于 洋，王小梅，田 鶴，梅晰凡，張振興

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 121001；2. 錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 121001)

0 引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療衛(wèi)生的發(fā)展，人們的壽命顯著延長(zhǎng)，老年人口高齡化趨勢(shì)日益明顯。伴隨年齡的增加，機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官不可避免地會(huì)發(fā)生生理性或病理性的改變，身體機(jī)能逐漸減弱[1]。大腦是人體耗氧量最大的器官，對(duì)衰老非常敏感，在腦衰老過(guò)程中，大量神經(jīng)細(xì)胞死亡，突觸數(shù)量減少，學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降[2-3]。鋅離子作為人體內(nèi)含量第二豐富的微量元素，與神經(jīng)元的存活和功能關(guān)系密切。鋅離子不能自由通過(guò)生物膜，其運(yùn)輸主要依靠鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc transporters, ZnT)家族和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Zrt-Irt like proteins, Zip)家族[4]。ZnT3是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)鋅穩(wěn)態(tài)的重要鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，ZnT3基因敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降[5]。在阿爾茨海默(Alzheimer’s disease, AD)模型小鼠的腦海馬內(nèi)ZnT3的表達(dá)量顯著下降，鋅離子穩(wěn)態(tài)失衡，神經(jīng)元凋亡增加[6]。在自然衰老過(guò)程中出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶能力下降是否也與ZnT3有關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試衰老對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、體視學(xué)和Western Blot技術(shù)對(duì)ZnT3在老年和青年小鼠海馬內(nèi)的定位分布和定量表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，并探索ZnT3影響學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

C57BL/6J小鼠，雄性，2月齡12只，20月齡12只，體重25～30 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物室，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。納入實(shí)驗(yàn)的老年組小鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)正常。兔抗鼠ZnT3抗體(proteintech)、兔抗鼠P-ERK和ERK抗體(abcam)、兔抗鼠GAPDH抗體(abcam)，SP9000免疫組化染色試劑、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物公司)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物公司)、羊抗兔二抗(abcam)、PVDF膜(millipore)、ECL發(fā)光液(諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 Morris水迷宮測(cè)試

青年組和老年組小鼠首先進(jìn)行5 d定位航行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)為120 s，小鼠面向池壁放入水中，從入水到找到平臺(tái)所需的時(shí)間即為潛伏期，若120 s內(nèi)沒(méi)有找到安全平臺(tái)，將小鼠人為放置在平臺(tái)上10 s，潛伏期記為120 s，每日訓(xùn)練兩次。實(shí)驗(yàn)第6天進(jìn)行空間搜索，撤走安全平臺(tái)，記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3 小鼠腦組織取材及標(biāo)本處理

隨機(jī)挑選青年組和老年組小鼠各5只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，小鼠麻醉后應(yīng)用4%多聚甲醛灌注固定，迅速剝離出大腦，冠狀面切開(kāi)，放入4%多聚甲醛溶液中固定，流水沖洗組織標(biāo)本，常規(guī)脫水，透明、浸蠟、包埋，切成5 μm薄片，用于免疫組織化學(xué)染色。另取青年組和老年組小鼠各7只，麻醉后快速取出全腦組織，分離出海馬，凍存于-80℃，用于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)小鼠腦海馬組織中ZnT3的表達(dá)

應(yīng)用SP法檢測(cè)小鼠腦組織中ZnT3蛋白的表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓修復(fù)抗原，PBS漂洗3次后加入山羊血清，封閉10 min后甩掉血清，滴加兔抗鼠ZnT3抗體(1∶200)，4℃孵育12～16 h。PBS漂洗后，依次滴加多聚物和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片。

1.5 體視學(xué)方法檢測(cè)小鼠腦海馬組織中ZnT3的表達(dá)量

青年組和老年組各隨機(jī)選取5張ZnT3免疫組化染色陽(yáng)性圖片，每張圖片按照“S”形選取5個(gè)高倍視野，應(yīng)用目鏡方格測(cè)試系統(tǒng)、點(diǎn)記數(shù)法測(cè)算ZnT3的體密度值。公式如下：VV=ΣPX/ΣPC，PX為方格測(cè)試系統(tǒng)落在陽(yáng)性表達(dá)部位的點(diǎn)數(shù)，PC為方格測(cè)試系統(tǒng)落在參照系的點(diǎn)數(shù)。

1.6 免疫印跡方法檢測(cè)小鼠腦海馬組織中ZnT3、P-ERK和ERK蛋白含量

取-80℃保存的小鼠海馬組織，裂解提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入SDS上樣緩沖液，加熱至100℃變性。12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒壓濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗鼠ZNT3 (1∶500)、兔抗鼠P-ERK (1∶1000)、兔抗鼠ERK (1∶1000)、兔抗鼠GAPDH (1∶3000)，4℃孵育16 h。TBST洗膜3次后加入羊抗兔IgG (1∶5000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后應(yīng)用ECL法顯色，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 青年小鼠和老年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，老年小鼠和青年小鼠尋找安全平臺(tái)的潛伏期均減少，但是同一訓(xùn)練時(shí)間，老年小鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于青年小鼠?？臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示老年小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于青年小鼠。這些結(jié)果表明，老年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，衰老影響了認(rèn)知能力。

圖1 青年和老年小鼠逃避潛伏期比較注：組間比較，*P<0.05,** P<0.01

圖2 青年和老年小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較注：組間比較，*P<0.05,** P<0.01

2.2 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內(nèi)ZnT3表達(dá)情況比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示ZnT3表達(dá)于小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及齒狀回(DG)內(nèi)錐體神經(jīng)元和顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。與青年小鼠比較，ZnT3在老年小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)均顯著減少，齒狀回內(nèi)ZnT3的陽(yáng)性表達(dá)也弱于青年組(圖3)。體視學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示，老年小鼠海馬組織CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回內(nèi)ZnT3陽(yáng)性表達(dá)的體密度值低于青年小鼠(表1)。免疫印跡結(jié)果與體視學(xué)結(jié)果一致，老年小鼠海馬組織中ZnT3蛋白含量下降明顯(圖4A, B)。

圖3 青年小鼠和老年小鼠腦海馬內(nèi)ZnT3表達(dá)(SP，scale bar =100 μm)

表1 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內(nèi)ZnT3體密度值

續(xù)表

2.3 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內(nèi)P-ERK和ERK蛋白含量比較

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)屬于MAPK家族，磷酸化的ERK從胞質(zhì)進(jìn)入胞核，介導(dǎo)多種因子的轉(zhuǎn)錄分化。本實(shí)驗(yàn)的免疫印跡結(jié)果顯示，老年小鼠海馬組織中ERK蛋白激酶的活性下降，P-ERK/ERK比值明顯小于青年組(圖4A, C)。

圖4 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內(nèi)ZnT3、P-ERK、ERK蛋白含量比較A：免疫印跡條帶；B：ZnT3含量分析；C：P-ERK/ERK，** P<0.01

3 討論

隨著科技的發(fā)展，人們的平均壽命大幅度延長(zhǎng)，我國(guó)的人口老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重。衰老不僅導(dǎo)致身體機(jī)能下降，也是造成AD和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等神經(jīng)退行性疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[7]。神經(jīng)系統(tǒng)作為人體重要的調(diào)節(jié)中樞最易受衰老影響，在衰老逐漸進(jìn)行的過(guò)程中腦組織萎縮、神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡、認(rèn)知能力退化、學(xué)習(xí)記憶能力下降[8]。腦衰老的機(jī)制極為復(fù)雜，建立衰老模型是探索衰老機(jī)制的前提，本研究應(yīng)用飼養(yǎng)20個(gè)月的小鼠進(jìn)行研究，其病理變化最接近于自然衰老。通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)證實(shí)20月齡的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，逃避潛伏期的時(shí)間明顯長(zhǎng)于青年小鼠，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于青年小鼠。

鋅是人體內(nèi)第二豐富的微量元素，是多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的組成成分，缺鋅可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[9]。神經(jīng)元內(nèi)的鋅離子游離存在，依靠特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。ZnT3分布于突觸小泡膜上，可向突觸小泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子，在突觸活動(dòng)時(shí)，鋅離子釋放，發(fā)揮其神經(jīng)調(diào)質(zhì)功能，影響突觸后神經(jīng)元的功能活動(dòng)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，AD小鼠海馬內(nèi)ZnT3表達(dá)下降，其突觸小泡內(nèi)鋅離子含量下降明顯；ZnT3基因敲除小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力明顯減弱[11-12]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、體視學(xué)測(cè)量和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了青年小鼠和老年小鼠海馬組織內(nèi)ZnT3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，老年小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及齒狀回內(nèi)ZnT3的陽(yáng)性表達(dá)均弱于青年小鼠。這一結(jié)果表明，衰老個(gè)體由于飲食等因素的影響，機(jī)體內(nèi)鋅離子含量減少，從而影響生理活動(dòng)。同時(shí)，由于ZnT3表達(dá)的下降，會(huì)導(dǎo)致鋅離子異常聚集于胞質(zhì)，突觸的功能受到抑制，加重學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ERK激酶是記憶形成的相關(guān)分子，海馬神經(jīng)元內(nèi)ERK通路蛋白含量豐富，調(diào)控認(rèn)知或發(fā)育[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，鋅離子和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體參與ERK信號(hào)通路的調(diào)控。ZnT3通過(guò)ERK通路影響神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激[14]。ZnT3基因敲除小鼠，其海馬神經(jīng)元再生能力下降，ERK信號(hào)通路被抑制[15]。本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)到衰老小鼠海馬組織內(nèi)P-ERK/ERK比值下降，ERK通路磷酸化水平降低。這也證實(shí)，自然衰老的腦組織中ZnT3表達(dá)下降，突觸小泡內(nèi)鋅離子含量減少，ERK通路被抑制，突觸后神經(jīng)元的功能受到影響，學(xué)習(xí)記憶能力下降。