譚 旭，王 鈺，陳澤林，隆 磊，劉運勝，王 平，史春夢

(1.陸軍軍醫(yī)大學,重慶 400038；2.華中科技大學，武漢 430063)

0 引言

近紅外熒光成像作為一種新興的生物醫(yī)學成像模態(tài),被廣泛應用于基礎科學研究以及臨床實踐,其核心在于研究開發(fā)具有疾病特異性靶向的近紅外熒光探針和對應的成像檢測設備。利用生物組織對近紅外光(通常指近紅外1區(qū)：700～900nm)的散射、吸收以及自發(fā)熒光顯著較低的特點，能獲得清晰的疾病組織結構圖像進而引導對疾病組織精確切除[1]。吲哚菁綠[ICG(Indocyanine Green)；發(fā)射波長～800 nm]，作為目前美國食品和藥物管理局(FDA) 唯一批準的近紅外熒光分子，已有50余年的臨床應用歷史。作用于視網膜和脈絡膜血管造影[2]、肝清除能力評估、胃腸道造影[3]、膽管造影[4]、輸尿管造影[5]、冠狀動脈造影[6]、甲狀旁腺造影[7]、腫瘤前哨淋巴結造影[8]以及成像引導下的腫瘤組織切除，如原發(fā)肝癌和結腸癌肝轉移病灶切除[9-12]，但是對于ICG在復雜創(chuàng)面中的應用尚缺乏研究。雖然ICG具有良好的臨床應用價值，但由于其體內半衰期短、難以被細胞特異性攝取以及缺乏疾病特異性靶向蓄積，將極大地限制其臨床應用前景。因此，亟需研發(fā)疾病選擇性蓄積的新型近紅外熒光探針[13]。目前用于臨床術中近紅外熒光成像的設備以美國的(Mini-FLARE)、法國的(Fluobeam)、加拿大的(SPYTM)以及日本的(PDETM)為代表[10]。它們均配備一個可移動的手持式探頭，其可以同時激發(fā)檢測區(qū)域并接收近紅外熒光信號。這些系統(tǒng)能夠通過實時術中顯影將腫瘤、血管和淋巴結等組織結構清晰地展現(xiàn)在外科醫(yī)生的手術視野中進而幫助它們準確地確定切除范圍。上述臨床手術導航系統(tǒng)雖然表現(xiàn)出良好的應用價值，但由于均為進口設備，相關研制技術對我國嚴格保密并被限制出口。因此，獨立自主地研究開發(fā)近紅外熒光手術導航系統(tǒng)具有重大的意義。本研究報道課題組圍繞近紅外熒光成像探針、成像系統(tǒng)和臨床轉化評價開展的探索研究，為開發(fā)近紅外熒光成像的臨床應用價值提供依據。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器設備

近紅外熒光成像系統(tǒng)Fluobeam及近紅外熒光成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ樣機(武漢華眸光電科技有限公司研制)，具備術中實時成像、精確定位疾病(如腫瘤)并清晰分辨疾病邊界以及同步采集可見光圖像與近紅外熒光圖像等功能。Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System，具有小動物活體熒光成像效果，同時基于其采集X-ray影像圖像的能力，精確定位疾病的解剖部位。

1.2 一般資料

納入研究代表性復雜創(chuàng)面病例包括：糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠節(jié)部分缺如患者和右手木炭火焰燒傷兒童患者；通過全身靜脈給予ICG后行損傷局部血管近紅外熒光成像；另納入結腸癌患者手術切除腫瘤組織離體標本經IR-780局部灌注后進行近紅外熒光成像。

1.3 近紅外熒光成像

對于糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠端部分缺如患者及手部燒傷患者進行損傷局部血管成像，于術前靜脈注射0.5 mg/kg ICG，然后立即于術中采集近紅外熒光圖像。對于結腸癌患者手術切除離體標本腫瘤及淋巴結顯影，獲取結腸癌患者手術切除的新鮮標本(0.5 h以內)后，將IR-780通過殘端動脈直接灌注到標本中，4 h后進行腫瘤及淋巴結近紅外熒光成像檢測，并將對應腫瘤組織及淋巴結進行冰凍切片，DAPI染色后通過激光共聚焦檢測IR-780的細胞攝取情況。

2 結果2.1 ICG對復雜創(chuàng)面的在體血管成像與評價

結果如圖1所示，由于損傷局部的血管及淋巴

圖1 ICG血管造影評估損傷局部血供情況A. 右足踇趾潰瘍兼遠端部分缺如患者的損傷局部血管造影；B. 右手木炭火焰燒傷患者的損傷局部血管造影

壓力不同，ICG能夠被動地擴散蓄積到損傷局部?；诮t外熒光成像系統(tǒng)Fluobeam獲得的近紅外熒光造影結果發(fā)現(xiàn)損傷局部的近紅外熒光信號出現(xiàn)更早、更強且持續(xù)時間更長。如圖1 A顯示，右足踇趾潰瘍兼遠端部分缺如患者的損傷局部在注射ICG后7 s即顯現(xiàn)出強烈的熒光信號，在13 s左右達到最強后急劇降低并維持穩(wěn)定，而其左側正常踇趾在注射后30 s才出現(xiàn)較為明顯的熒光信號，在45 s左右達到最強并緩慢降低，在注射后120 s兩側踇趾熒光信號強度均顯著降低且兩者之間無明顯差別。如圖1B顯示，右手木炭火焰燒傷患者的損傷局部在注射ICG后23 s檢測出強烈的熒光信號，在27 s左右達到最強，而其左側正常手部在注射后35 s才出現(xiàn)較為明顯的熒光信號，在50 s左右達到最強并緩慢降低，在注射后180 s后左側手部熒光信號消失而右側損傷手部仍殘留比較明顯的熒光信號。

2.2 IR-780對手術切除腫瘤組織的特異性識別及淋巴結成像

針對代表性病例，將IR-780通過殘端動脈灌注的方式直接將其注入臨床結腸癌病人標本中，37℃孵育4 h后通過Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System進行近紅外熒光成像檢測，結果如圖2A所示，IR-780能夠識別出局部的腫瘤病灶

圖2 IR-780的腫瘤特異性識別及淋巴結顯影A. 結腸癌標本的X-ray成像及特異性IR-780近紅外熒光成像圖片；B. 從結腸癌標本中分離的淋巴結近紅外熒光成像及激光共聚焦檢測圖片

(藍色箭頭所指部位)。進一步通過觸摸的方法分離出 8個淋巴結，其中6個有較強的IR-780熒光信號。分別挑選780陽性和陰性熒光信號淋巴結(②和①)制作冰凍切片并進行DAPI染色，然后通過激光共聚焦檢測IR-780的細胞攝入情況。結果如圖2B所示，在IR-780陽性信號淋巴結中檢測到對IR-780特異性攝入的細胞，推測這些細胞可能為轉移到淋巴結的腫瘤細胞。

2.3 近紅外成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ的功能評價

基于上述研究基礎，開展對國產近紅外應成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ的評價研究，如圖3A和圖3B所示，該系統(tǒng)通過術前給受檢測對象注射近紅外熒光探針，利用探針在病變部位選擇性地蓄積特性，然后通過近紅外光源(700～900 nm)激發(fā)探針獲得比激發(fā)光源波長更長的近紅外熒光信號，同時通過近紅外相機和彩色相機的信號接收器(CCD)分別接收熒光信號和可見光信號，并通過信息處理后將成像圖片顯示在顯示屏幕上。本成像系統(tǒng)具有高度集成便捷、成像速度快(30 fps)、成像視場大(100 mm×100 mm)、空間分辨率高以及同步采集可見光彩色圖像與近紅外熒光圖像等主要優(yōu)勢。建立4T1乳腺癌荷瘤C57小鼠模型，尾靜脈注射IR-780,24 h后通過TPS-785-Ⅲ近紅外手術導航系統(tǒng)采集近紅外熒光成像圖像。結果如圖3C和圖3D所示，IR-780具有良好的腫瘤靶向顯影能力，顯示出TPS-785-Ⅲ系統(tǒng)具有良好近紅外成像功能。

圖3 TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像系統(tǒng)的外觀、工作原理以及應用實例A. TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像系統(tǒng)外觀圖片；B. TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像統(tǒng)工作原理；C. C57荷瘤小鼠活體近紅外熒光成像圖像；D. 4T1乳腺癌荷瘤小鼠離體組織器官近紅外熒光成像圖像

3 討論

用于生物醫(yī)學光學成像的理想激發(fā)和發(fā)射光譜應該具有較低的光散射、最低限度的組織吸收、可以忽略的自發(fā)熒光，疾病部位和正常部位之間能夠獲得良好的信噪比。近紅外熒光包括傳統(tǒng)的近紅外1區(qū)(NIR-1：700～900 nm)及近紅外2區(qū)(NIR-2：1000～1700 nm)源，由于組織光散射、光吸收及自發(fā)熒光顯著低于其他波段光源，因此,具有更深的組織穿透能力以及更高的信噪比，能夠實現(xiàn)更深層組織的光學成像，進而靶向識別并實時動態(tài)監(jiān)測深部疾病部位并引導對疾病組織精確切除。

本課題組前期在國際上首次報道以IR-780為代表近紅外七甲川花菁類熒光小分子探針，它們依賴于結構內在特性可被腫瘤細胞選擇性攝取并蓄積于腫瘤細胞線粒體[14-15]。該類近紅外熒光小分子在多種荷瘤動物模型中表現(xiàn)出良好腫瘤成像能力以及腫瘤光熱、光動力和化學治療活性。本文首次在結腸癌病人標本中探索了IR-780的腫瘤及淋巴結成像能力，結果發(fā)現(xiàn)IR-780能夠特異性識別區(qū)分癌變組織及腫瘤細胞轉移淋巴結。研究表明腫瘤細胞淋巴結轉移是預測病理分期及病人預后的關鍵指標，因此，我們認為IR-780具有精確引導對惡性病變組織切除并最大限度保留正常組織以及腫瘤轉移淋巴結清掃的能力，表現(xiàn)了較好臨床轉化應用的前景。

本文一方面利用法國的Fluobeam手術導航系統(tǒng)，評估了ICG對復雜創(chuàng)面的在體血管成像效果。通過糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠端部分缺如患者及手部燒傷患者的損傷局部血管造影結果證實，基于ICG的近紅外成像在復雜創(chuàng)面?zhèn)樵u估中有較好的臨床應用價值。另一方面，基于上述研究基礎，我們協(xié)作開展對武漢華眸光電科技有限公司研制的近紅外熒光成像系統(tǒng)評價研究，通過腫瘤特異性靶向的IR-780熒光探針小鼠體內實驗。我們證實TPS-785-Ⅲ近紅外成像系統(tǒng)具有穩(wěn)定的近紅外成像能力，且該成像系統(tǒng)高度集成便捷、成像速度快、成像視場大、空間分辨率高以及能同步采集可見光彩色圖像與近紅外熒光圖像，表現(xiàn)出進一步開發(fā)前景。