任雅麗，徐 進(jìn)，程 明，周 晶，黃晨詩，柴立軍

(北京大學(xué) 第一醫(yī)院電鏡室，北京 100034)

0 引言

腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)厚度變化對于一些臨床疾病的診斷具有重要意義。例如，薄基底膜腎病是以GBM變薄為主要病理表現(xiàn)的疾病，臨床上表現(xiàn)為血尿，診斷必須依靠電鏡對GBM厚度進(jìn)行測量；糖尿病腎病則表現(xiàn)為GBM彌漫均質(zhì)性增厚，尤其是早期病變，GBM增厚可能是患者在組織學(xué)上的唯一特征，是確診的關(guān)鍵依據(jù)。目前，與GBM厚度相關(guān)腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)都是參照國外的建議來執(zhí)行的[1-2]。這些標(biāo)準(zhǔn)的制定是基于正常人群的GBM厚度。在臨床工作中，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，按照國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷時，有些患者的臨床表現(xiàn)與形態(tài)學(xué)特征會有相當(dāng)程度的不吻合，其中的原因主要是由于參考值不適合所引起。目前對于正常GBM厚度的報道不一，應(yīng)用各種有病變的腎組織、利用以往他人的研究資料或者無性別和年齡匹配的GBM厚度作對照都是不妥的。國內(nèi)尚無系統(tǒng)的研究結(jié)果可供參考。由于正常人的腎組織獲取比較困難，希望能有更多的替代組織用于研究分析。既往的研究提示，腎小球微小病變(minimal change disease, MCD)可能作為替代方案之一[3]。因此，我們需要了解MCD患者的GBM厚度。為了減小年齡因素的影響，我們選擇41～50歲的患者作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 樣本的選擇

選擇2015—2021年在北京大學(xué)第一醫(yī)院住院并行腎穿刺診斷為MCD的41～50歲患者作為研究對象，所有入組樣本均滿足以下條件:臨床上無血尿、高血壓、糖尿病及遺傳性腎臟病等可能影響GBM厚度的疾病，患者未經(jīng)過相關(guān)藥物治療；組織免疫熒光染色全部為陰性，或僅有少量非特異性IgM沉積；光鏡下腎小球形態(tài)正?；騼H見系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度節(jié)段性增生，伴或不伴腎小管和腎間質(zhì)急性損傷；透射電鏡下顯示GBM無分層、無明顯皺縮、上皮足突廣泛融合。符合入組條件的樣本共30例，其中男性13例，女性17例；肥胖(BMI≥28)患者5例(男性1例，女性4例)，不肥胖(BMI<28)14例(男女各7例)，余11例BMI情況不詳；吸煙史(大于10年，每天超過10支)的患者9例(男性8例，女性1例)。

1.2 組織處理和攝片方法

腎穿刺新鮮標(biāo)本經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，梯度酒精脫水后用Epon812包埋，3 μm半薄切片行甲苯胺藍(lán)染色，每個樣本選擇一個結(jié)構(gòu)良好的腎小球進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后于JEOL 1230型透射電鏡下進(jìn)行觀察。透射電鏡的條件統(tǒng)一設(shè)定為60 kV，燈絲飽和度設(shè)為75%，在15 000倍的放大倍數(shù)下拍攝數(shù)碼圖像。照相時遵循等距離移動原則，對每張切片上的腎小球均拍照10～15張。

1.3 GBM截面寬度的測量方法

所攝取照片在Scandium測試系統(tǒng)(Olympus)下隨機(jī)設(shè)置測試網(wǎng)格，測試線與GBM足細(xì)胞側(cè)相交處作為測量的起始點，向與GBM垂直的方向作延長線到達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相交處，線段的長度即該點處GBM的截面寬度。以下區(qū)域GBM不作測量：血管極、系膜區(qū)、內(nèi)皮下間隙增寬處、GBM皺縮處或毛細(xì)血管腔開放不良處。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，GBM厚度用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同性別、肥胖與否及有無吸煙史的MCD患者之間GBM厚度的差別性比較采用t檢驗，年齡與GBM厚度的相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，采用P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

隨機(jī)設(shè)置的網(wǎng)格線與每張照片內(nèi)GBM的有效交點數(shù)為1～12個，每個病例測量有效截面寬度的數(shù)量為71.93±17.81(38～114)個，測量情況如圖1所示。全部30例樣本GBM的平均截面寬度為314.21±42.22(256.97～393.51) nm，其中男性為360.30±47.0(256.97～452.43) nm，女性為314.21±42.22(256.97～393.51) nm，兩組之間差別有顯著性(P=0.009)；不同性別在該年齡段的GBM厚度與年齡增長的相關(guān)性均無顯著性(P>0.05)。同時，不同性別組患者GBM平均截面寬度與其是否肥胖、是否長期吸煙之間未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(P>0.05)。本研究對每一例樣本各點測量值的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同性別患者測量值的標(biāo)準(zhǔn)差有顯著性差異(P=0.009)，男性高于女性。

圖1 GBM截面寬度的測量方法(TEM，×15 000)隨機(jī)設(shè)置的網(wǎng)格線與GBM足細(xì)胞側(cè)有5處交點，有效測量5處。

3 討論

腎小球是血液濾過的基本結(jié)構(gòu)，其中，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、GBM和足細(xì)胞的裂孔膜共同構(gòu)成腎小球的濾過屏障，任何一項結(jié)構(gòu)的改變都可能導(dǎo)致腎小球疾病的發(fā)生，包括GBM厚度的改變。與GBM變薄相關(guān)的常見疾病是薄基底膜腎病、Alport綜合征和良性家族性血尿，GBM增厚則最常見于糖尿病腎病，且GBM厚度與腎小球濾過率、糖尿病腎病的診斷和預(yù)后相關(guān)[4-5]。判斷GBM增厚或變薄與否需要與其正常厚度相比較。正常GBM厚度的研究數(shù)據(jù)主要來源于早年有限的幾組國外數(shù)據(jù)[6-9]。在GBM的影響因素方面，少數(shù)研究認(rèn)為與性別無關(guān)[10-11]，但是大多數(shù)研究表明，GBM厚度與性別、年齡、測量方法及組織處理等方面都相關(guān)[11-12]，其是否與種族相關(guān)目前未見報道。我國正常人群中GBM厚度的數(shù)據(jù)非常少，劉林昌等[13]的研究中主要關(guān)注了性別的差別，由于病例少、年齡跨度大，無法對不同年齡因素進(jìn)行系統(tǒng)分析。由于不同年齡段GBM厚度不同，因此有必要縮窄年齡段進(jìn)行分析。但是，實際工作中獲取足夠數(shù)量的正常人腎組織比較困難，如果能以現(xiàn)有腎穿刺患者標(biāo)本庫中的樣本進(jìn)行替代，就可以完成這些工作。已有的證據(jù)表明，經(jīng)過長時間激素治療的MCD患者的GBM增厚，但是沒有證據(jù)顯示未經(jīng)治療的MCD患者GBM相比正常腎組織的厚度發(fā)生變化。

Danilewicz等[3]的研究顯示，MCD患者與正常人GBM厚度相比差別無顯著性，提示將這類患者標(biāo)本用于分析正常人GBM厚度的可能性。本研究希望了解符合入組條件的MCD患者的GBM厚度，以便后期分析是否可以將其作為正常GBM厚度的數(shù)據(jù)。在選擇MCD入組病例時，我們從臨床和組織病理水平排除了已知可能影響GBM厚度的相關(guān)因素，包括糖尿病、血尿、遺傳性腎臟病、激素治療等因素，測量時也剔除了可能不代表GBM正常厚度的區(qū)域，例如系膜區(qū)、血管極、內(nèi)皮下間隙增寬、GBM皺縮或者開放不良處。

GBM測量最常用的方法是正交截距法，由Jensen等[14]最早于1979年發(fā)表，他們建議將該方法用于GBM測量。簡言之，就是在顯微照片上放置等距離相交線的網(wǎng)格，在網(wǎng)格上的一條線截取內(nèi)皮細(xì)胞GBM界面的每個點上進(jìn)行GBM測量。為了減小由于切面原因?qū)е翯BM厚度的不準(zhǔn)確，Gundersen等[15]建議通過校正求出GBM的調(diào)和平均厚度來代表GBM的真正厚度。但是，計算調(diào)和平均厚度比較復(fù)雜，不適用于臨床工作。因此，實際使用中直接測量GBM截面寬度更可行，如果方法使用得當(dāng)，兩種測量完全具有可比性[16]。為了在臨床工作中便于實施和數(shù)據(jù)比對，本研究對GBM截面寬度進(jìn)行測量，采用算數(shù)平均值表示GBM厚度而不計算調(diào)和平均厚度。

本研究結(jié)果顯示，GBM平均截面寬度在不同性別的患者中有顯著性差異(P=0.009)，男性高于女性，這與以往的大部分報道是相同的[8，13,17]。進(jìn)一步證明，GBM厚度的性別差異。同時，也證明GBM平均截面寬度在41～50歲年齡段內(nèi)與年齡不相關(guān)，GBM厚度相對恒定。在對患者的臨床資料進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，GBM平均截面寬度的測量值與患者是否肥胖、是否有吸煙史無關(guān)。鑒于進(jìn)一步分組時總樣本量偏小，且不同組別之間樣本量差別大，該結(jié)果未必能代表實際情況，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析，以證實相關(guān)結(jié)論。在此基礎(chǔ)上，對每個樣本的測量值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)男性患者的測量值標(biāo)準(zhǔn)差與女性患者相比差異有顯著性(P=0.009)，男性患者的變異情況更明顯，也就是說同一病例中，男性患者的測量值更不均一。這其中的影響因素還有待于進(jìn)一步分析。

總之，在對41～50歲未經(jīng)治療的MCD患者GBM截面寬度的分析中發(fā)現(xiàn)，該年齡段患者的GBM厚度恒定，且男性比女性厚。