吳 悠，賴云菲，趙海霞，董 霽，徐新萍，趙 黎，張 靜，王 惠，姚斌偉，王浩宇，彭瑞云

(軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850)

0 引言

微波是指300 MHz～300 GHz的電磁波。隨著工業(yè)、軍事等領(lǐng)域的發(fā)展，微波已被廣泛應(yīng)用于生活的各個(gè)方面。腦是微波輻射最敏感的靶器官之一。既往研究表明，一定劑量的微波輻射可導(dǎo)致大鼠記憶功能下降[1-3]。識(shí)別記憶是識(shí)別與回憶的集合，主要包含兩種主觀體驗(yàn)：一種是熟悉感; 另一種是回憶。識(shí)別記憶是人類和動(dòng)物辨認(rèn)熟悉與陌生事務(wù)，降低后續(xù)學(xué)習(xí)成本的重要認(rèn)知功能[4]。然而，既往研究主要關(guān)注微波輻射對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響[5]，針對(duì)連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射對(duì)大鼠識(shí)別記憶的影響及相關(guān)腦組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究尚未見報(bào)道。

本研究采用新物體識(shí)別(novel object recognition, NOR)實(shí)驗(yàn)范式檢測(cè)連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射后大鼠識(shí)別記憶功能的改變。同時(shí)，采用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和尼氏體染色方法檢測(cè)定性及定量地對(duì)微波輻射后大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)以及功能狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估，以期為連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射致識(shí)別記憶功能損傷的診斷和防治方法的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究使用36只9周齡雄性Wistar大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，中國)，體重220～240 g，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(sham組)和輻射組(exposure組)，每組18只。動(dòng)物飼養(yǎng)期間可以自由的獲取水和食物，飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度40%～55%，時(shí)間控制為12 h光照/12 h黑暗，光照時(shí)間早9:00—晚9:00，黑暗時(shí)間晚9:00至早9:00。行為學(xué)檢測(cè)在光照時(shí)間的中間時(shí)段進(jìn)行。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均獲得了充足的休息。所有實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)指南，盡量減少動(dòng)物的痛苦并減少使用動(dòng)物的數(shù)量。

1.2 微波輻射方法

將大鼠固定在有機(jī)玻璃盒中。采用微波輻射源對(duì)大鼠進(jìn)行全身均勻輻射。輻射期間將大鼠裝進(jìn)圓形輻射盒內(nèi)，頭部朝向輻射源中心。每天輻射時(shí)長(zhǎng)30 min/d共5 d，輻射平均功率密度為50 mW/cm2。對(duì)照組不接受微波輻射，其余控制條件與輻射組相同。

1.3 新物體識(shí)別測(cè)試

使用新物體識(shí)別的實(shí)驗(yàn)范式測(cè)量大鼠的識(shí)別記憶。在輻射前1 d、輻射后1 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。新物體識(shí)別曠場(chǎng)大小為50 cm×50 cm×40 cm，每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前允許在曠場(chǎng)內(nèi)自由探索10 min以適應(yīng)環(huán)境，保證其實(shí)驗(yàn)時(shí)不會(huì)因緊張而影響識(shí)別。新物體識(shí)別測(cè)試分為學(xué)習(xí)階段和測(cè)試階段，每個(gè)階段均為5 min，學(xué)習(xí)階段在曠場(chǎng)內(nèi)左右對(duì)稱位置放置兩個(gè)完全相同的物體，測(cè)試階段將其中一個(gè)物體換成大小相近形狀完全不同的物體。使用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)軟件Anymaze(Stoelting, USA)進(jìn)行動(dòng)物行為記錄和數(shù)據(jù)記錄。共記錄測(cè)試階段的移動(dòng)距離、平均速度和辨別指數(shù)(discrimination index, DI:DI=TN/(TN+TF)，其中TN為大鼠探索新物體時(shí)間，TF為大鼠探索舊物體時(shí)間)。

1.4 大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)觀察

各組大鼠于微波輻射5 d后，用1%的戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，將腦部完整取出后放置于冰盒上，取右腦部分放入福爾馬林中固定兩周。固定完成后，取海馬部分最大面，沿海馬方向切成厚度約0.5 cm的腦組織放入包埋盒中。將腦組織用流水沖洗12 h后放入自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。將脫水完成的腦組織進(jìn)行石蠟包埋，并修剪成一致大小。將腦組織放在石蠟切片機(jī)上切成3 μm厚度的切片，將切片平鋪于載玻片上，置于60℃恒溫箱內(nèi)干燥過夜。將制備好的切片放入不同濃度梯度的酒精中浸泡脫臘，脫臘完成后放在溫水中保持。按順序分別放在蘇木素染液浸泡12 min，伊紅染液浸泡 3 min。染色完成后按順序放置于不同濃度梯度的酒精和二甲苯中脫水。脫水完成后使用中性樹脂封片并使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體染色和定量分析

取微波輻射后5 d的海馬組織切片脫臘完成后放在溫水中保持(同HE染色)。將切片放入甲苯胺藍(lán)染液中染色10 min，然后在95%酒精中分化3 s，梯度乙醇和二甲苯脫水后，用中性樹膠封片。染色完成后使用電子顯微鏡觀察并拍照記錄。將拍攝的海馬區(qū)尼氏體圖像使用Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics, USA)進(jìn)行平均光密度(mean optical density, MOD)定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件(IBM, America)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，使用箱須圖法剔除異常數(shù)據(jù)。文中數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)表述，使用P值比較組間差異，置信區(qū)間95%，P<0.05被認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠微波輻射前后體重變化

大鼠微波輻射前后體重如圖1A和1B所示。微波輻射前，輻射組和對(duì)照組大鼠體重相近，無明顯差異。微波輻射5 d后，輻射組與對(duì)照組體重?zé)o顯著差異。

圖1 微波輻射前后對(duì)照組和輻射組大鼠體重比較A：微波輻射前對(duì)照組和輻射組大鼠體重；B：微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠體重

2.2 微波輻射后大鼠識(shí)別記憶能力降低

微波輻射后新物體識(shí)別時(shí)各組大鼠移動(dòng)距離如圖2A所示，輻射組大鼠移動(dòng)距離顯著低于對(duì)照組(n=18,P<0.05)。電磁輻射后新物體識(shí)別時(shí)各組大鼠平均速度如圖2B所示，輻射組大鼠平均速度顯著低于對(duì)照組(n=18,P<0.05)。電磁輻射后新物體識(shí)別時(shí)各組大鼠辨別指數(shù)如圖2C所示，輻射組大鼠辨別指數(shù)顯著低于對(duì)照組(n=18,P<0.05)。

圖2 微波輻射后新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和輻射組大鼠移動(dòng)距離、平均速度、辨別指數(shù)比較A：微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠移動(dòng)距離；B：微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠平均速度；C：微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠辨別指數(shù)。*示P<0. 05

2.3 微波輻射后大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)損傷

通過光學(xué)顯微鏡觀察可見，對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列整齊，胞質(zhì)均勻(圖3A和圖3C)。微波輻射組大鼠海馬組織損傷明顯，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元核固縮、深染，以CA3區(qū)最為明顯(圖3B和3D)。

圖3 微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果比較A：微波輻射后對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 100 μm)；B：微波輻射后輻射組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 100 μm)；C：微波輻射后對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 50 μm)；D：微波輻射后輻射組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)(Scale bar= 50 μm)

2.4 大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體含量變化

對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量豐富(圖4A和圖4C)，輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量明顯減少(圖4B和圖4D)。定量分析表明，輻射組大鼠海馬組織神經(jīng)元尼氏體平均光密度(mean optical density, MOD)與對(duì)照組相比顯著降低(n=6,P<0.05)。

圖4 微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠海馬尼氏體染色結(jié)果比較A：微波輻射后對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量豐富(Scale bar= 100 μm)；B：微波輻射后輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量明顯減少(Scale bar= 100 μm)；C：微波輻射后對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量豐富(Scale bar= 50 μm)；D：微波輻射后輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體圖像，示尼氏體含量明顯減少(Scale bar= 50 μm)。E：微波輻射后對(duì)照組和輻射組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體平均光密度(MOD)比較。*示P<0.05

3 討論

隨著電子技術(shù)的發(fā)展，電磁輻射逐漸成為繼空氣、水體、噪聲污染之后的第四大環(huán)境污染源[6]。腦是微波輻射的敏感靶器官，既往研究表明，微波輻射會(huì)對(duì)大鼠腦組織結(jié)構(gòu)造成損傷，從而引起相關(guān)認(rèn)知功能障礙。Karimi N等[7]發(fā)現(xiàn)2.45 GHz微波輻射會(huì)導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損。Ma D等[8]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可以導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，以及海馬組織中氨基酸類、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂。徐新萍等[9]發(fā)現(xiàn)10 mW/cm2微波連續(xù)輻射3 d后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)異常。

然而，目前針對(duì)連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射造成的識(shí)別記憶障礙及其組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究尚未見報(bào)道。許多神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默癥、精神分裂癥)均會(huì)對(duì)識(shí)別記憶能力造成影響[10-12]。新物體識(shí)別是評(píng)估嚙齒動(dòng)物對(duì)新異物體偏好的方法?？梢詫?duì)動(dòng)物的識(shí)別記憶進(jìn)行評(píng)估[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在新物體識(shí)別檢測(cè)中，在50 mW/cm2微波輻射后，與對(duì)照組相比輻射組大鼠移動(dòng)距離和平均速度均顯著下降(移動(dòng)距離：P<0.05，平均速度：P<0.05)，表明大鼠的運(yùn)動(dòng)欲望和運(yùn)動(dòng)能力顯著減弱。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比輻射組大鼠辨別指數(shù)顯著下降(P<0.05)，表明大鼠的對(duì)新異物體的識(shí)別和探索欲望降低，提示50 mW/cm2連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射后大鼠識(shí)別記憶出現(xiàn)障礙。

海馬區(qū)是識(shí)別記憶執(zhí)行所依賴的重要腦區(qū)，海馬結(jié)構(gòu)的損傷與識(shí)別記憶功能障礙密切相關(guān)[14]。為了闡明連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射誘發(fā)大鼠識(shí)別記憶障礙的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們對(duì)輻射后大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)分別進(jìn)行了定性和定量的檢測(cè)和分析。一方面，一定劑量微波輻射可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷[15-17]。李文潮等[18]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可導(dǎo)致海馬組織DG去錐體細(xì)胞胞漿部分胞盒呈陽性。Zhao L等[16]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射后大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，主要表現(xiàn)為海馬組織輕度水腫、線粒體嵴不規(guī)則、腫脹、空泡化。本研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射后，輻射組大鼠與對(duì)照組大鼠相比， 海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常，主要表現(xiàn)為核固縮、深染。另一方面，既往研究表明，一定劑量微波輻射可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體的含量下降。Chen J等[5]發(fā)現(xiàn)連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射均可導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體減少。任俊輝等[19]發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2微波輻射可以導(dǎo)致大鼠海馬和皮層神經(jīng)元尼氏體含量均顯著減少。尼氏體主要由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的核糖體組成，是神經(jīng)元的重要結(jié)構(gòu)特征，且與神經(jīng)元的狀態(tài)和功能密切相關(guān)。當(dāng)神經(jīng)元損傷時(shí)，尼氏體往往會(huì)溶解消失。因此，尼氏體染色可反映神經(jīng)元的損傷情況。在本研究中，50 mW/cm2微波輻射后大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體含量減少。上述結(jié)果提示，連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射造成的識(shí)別記憶障礙的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為海馬神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷。

綜上，連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射可造成大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)損傷，從而引發(fā)大鼠識(shí)別記憶障礙。本研究首次探索了連續(xù)高劑量、連續(xù)高強(qiáng)度微波輻射對(duì)大鼠識(shí)別記憶的影響，為其損傷診斷和防治方法的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。