張星星,楊 磊,劉 芳,張 瑾,常麗花,馬運(yùn)峰

(1西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)系,西安 710049;2西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:mayunfeng@xjtu.edu.cn)

肺癌是造成世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。其中,非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要亞型,約占肺癌總數(shù)的85%[1]。根據(jù)組織學(xué)特性的不同,非小細(xì)胞肺癌又可分為肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌(肺鱗癌)和大細(xì)胞癌[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),約30%的非小細(xì)胞肺癌是肺鱗癌[3]。由于科研和醫(yī)療技術(shù)水平的提升,肺鱗癌的治療取得了很大的進(jìn)步,但肺鱗癌患者的預(yù)后依然很差[4]。因此,尋找肺鱗癌相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物并研究其分子機(jī)制對(duì)肺鱗癌診斷具有重要意義,同時(shí)可開(kāi)發(fā)針對(duì)生物標(biāo)記物的靶向治療方法。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)作為RNA的類型之一,其長(zhǎng)度超過(guò)200 nt,但不具備蛋白編碼能力[5]。近年來(lái),由于lncRNA在不同類型的人類疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用而被廣泛研究。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程,進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展[6-8]。盡管有報(bào)道稱lncRNA CASC9(癌癥易感性候選者9)與肺鱗癌的進(jìn)展呈正相關(guān)[9],但其在肺鱗癌中的潛在分子機(jī)制還有待研究。

因此,本研究旨在揭示肺鱗癌中l(wèi)ncRNA CASC9的表達(dá)水平,并進(jìn)一步探討其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胚腎細(xì)胞系293T、人正常肺細(xì)胞系BEAS-2B和肺鱗癌細(xì)胞系(SK-MES-1、NCI-H520、H1703和H2170)均購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。lncRNA CASC9的干擾物(si-CASC9-1和si-CASC9-2)和陰性對(duì)照(NC),以及l(fā)ncRNA CASC9的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(CASC9)和陰性對(duì)照(NC)購(gòu)自上海Gene Pharma公司。miR-195-5p mimics和陰性對(duì)照NC mimics,以及miR-195-5p inhibitor和陰性對(duì)照NC inhibitor購(gòu)自廣州RiboBio公司。一抗(CDK6和GAPDH)和二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞放置在充滿5% CO2的培養(yǎng)箱中,用含有10% FBS(HyClone, USA)、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基(HyClone, USA)培養(yǎng)。細(xì)胞接種于6孔板中,待融合度達(dá)到80%時(shí),根據(jù)試劑商提供的說(shuō)明書(shū)用lipofectamine 3000(Invitrogen,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,所有相關(guān)的轉(zhuǎn)染分組在后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法中根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

為了研究CASC9對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響,首先將si-CASC9-1和si-CASC9-2轉(zhuǎn)染到SK-MES-1和H1703細(xì)胞以干擾CASC9的表達(dá)。每種細(xì)胞中分3組:NC、si-CASC9-1和si-CASC9-2。

為了探討CASC9和miR-195-5p是否通過(guò)CDK6影響癌細(xì)胞的增殖能力,用SK-MES-1和H1703細(xì)胞分別進(jìn)行了如下2個(gè)實(shí)驗(yàn)的共轉(zhuǎn)染:miR-195-5p與CDK6共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的分為NC inhibitor+si-NC組、NC inhibitor+si-CDK6組和miR-195-5p inhibitor+si-CDK6組;CASC9與CDK6共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中分為NC+si-NC組、NC+si-CDK6組和CASC9+si-CDK6組。

根據(jù)以上不同的實(shí)驗(yàn)和分組進(jìn)行鋪板,肺鱗癌細(xì)胞以3 000/孔的數(shù)量接種在96孔板中,細(xì)胞轉(zhuǎn)染0,24,48,72 h每孔加入10 μl CCK8(Dojindo)工作液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,培養(yǎng)結(jié)束測(cè)定吸光度在450 nm處的吸光度值,細(xì)胞增殖能力根據(jù)CCK8試劑商提供的說(shuō)明書(shū)計(jì)算。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

利用Transwell實(shí)驗(yàn)去研究干擾CASC9對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。SK-MES-1和H1703細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),每種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染分為NC組、si-CASC9-1組和si-CASC9-2組。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并重懸,取200 μl用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的(5×104個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液加到Transwell小室的上室中(8 μm pore, Corning, USA),下室加600 μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。48 h后用4%的多聚甲醛室溫固定15 min,以0.1%結(jié)晶紫染色15 min并用PBS沖洗干凈。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中Transwell小室用基質(zhì)膠(Corning, USA)進(jìn)行包被,其余實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證CASC9和miR-195-5p的潛在靶基因

為了驗(yàn)證CASC9與靶基因miR-195-5p、以及miR-195-5p與靶基因CDK6之間的相互結(jié)合作用,我們構(gòu)建了具有與miR-195-5p結(jié)合位點(diǎn)的CASC9或CDK6野生型和突變型報(bào)告質(zhì)粒。將具有miR-195-5p結(jié)合位點(diǎn)的CASC9和CDK6的野生型序列與突變序列分別克隆到熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO(Promega, China)中,得到CASC9野生型(CASC9-WT)、CASC9突變型(CASC9-MUT)、CDK6野生型(CDK6-WT)和CDK6突變型(CDK6-MUT)報(bào)告質(zhì)粒。

CASC9和miR-195-5p熒光素酶實(shí)驗(yàn)分為:CASC9-WT+NC mimics組、CASC9-WT+miR-195-5p mimics組、CASC9-MUT+NC mimics組和CASC9-MUT+miR-195-5p mimics組。CDK6和miR-195-5p熒光素酶實(shí)驗(yàn)分為:CDK6-WT+NC mimics組、CDK6-WT+miR-195-5p mimics組、CDK6-MUT+NC mimics組和CDK6-MUT+miR-195-5p mimics組。根據(jù)以上分組將相應(yīng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞系293T中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并裂解,利用熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)檢測(cè)熒光活性。

1.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CASC9、miR-195-5p和CDK6的表達(dá)

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)肺正常細(xì)胞系(BEAS-2B)以及肺鱗癌細(xì)胞系(SK-MES-1、NCI-H520、H1703和H2170)中CASC9、miR-195-5p和CDK6的表達(dá)。

為了確認(rèn)CASC9的干擾效率,將肺鱗癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC、si-CASC9-1和si-CASC9-2,用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肺鱗癌細(xì)胞中CASC9的表達(dá)水平。

為了研究CASC9和miR-195-5p的表達(dá)是否具有相互調(diào)節(jié)作用,通過(guò)對(duì)肺鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-195-5p或干擾CASC9后,用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中CASC9和miR-195-5p的表達(dá)。

根據(jù)以上不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞,之后收集細(xì)胞并向細(xì)胞樣品中加入Trizol后超聲勻漿提取總的RNA并檢測(cè)RNA濃度。取1 μg RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為:5×RNA逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl;RNA 1 μg;DEPC水補(bǔ)到10 μl。反應(yīng)程序?yàn)?42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。之后通過(guò)SYBR Premix EX Taq試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR儀中進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系為:2×Real time-PCR聚合酶10 μl;cDNA 0.5 μl;正向引物0.5 μl;反向引物0.5 μl,DEPC水補(bǔ)到20 μl。96孔板每孔加20 μl上述混合物后進(jìn)行上機(jī)反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))。GAPDH作為CASC9和CDK6的內(nèi)參,U6作為miR-195-5p的內(nèi)參。

1.7 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CDK6的蛋白表達(dá)水平

為了確定miR-195-5p和CASC9對(duì)CDK6蛋白表達(dá)的影響,將肺鱗癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC mimics或miR-195-5p mimics、以及NC或CASC9。根據(jù)以上分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。收集不同處理組的肺鱗癌細(xì)胞并提取蛋白。用RIPA裂解液(碧云天,北京)重懸細(xì)胞后將細(xì)胞裂解,4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min,收集蛋白上清液,用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,北京)檢測(cè)蛋白濃度,并將蛋白樣品煮沸變性。用10%的SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質(zhì),電泳結(jié)束后將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。利用5%的脫脂奶粉將膜室溫封閉2 h,隨后將膜與一抗(CDK6,1 ∶1 000;GAPDH,1 ∶10 000)在4 ℃過(guò)夜敷育。TBST洗去未結(jié)合的一抗后使膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)室溫結(jié)合1 h。TBST洗3次,每次10 min。滴加ECL反應(yīng)液(Thermo Fisher,USA)于膜上,室溫進(jìn)行顯色反應(yīng),用Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。Image J軟件進(jìn)行灰度分析并計(jì)算相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.8 生物信息學(xué)分析

為了研究CASC9、miR-195-5p和CDK6在LUSC中的表達(dá),以及預(yù)測(cè)CASC9和miR-195-5p的靶基因,我們采用生物信息學(xué)進(jìn)行了相關(guān)分析。

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了CASC9在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“CASC9”并選擇肺鱗癌“LUSC”,則可獲得CASC9在癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)的箱線圖。

CASC9在肺腺癌患者不同階段的表達(dá)利用Lnc2Cancer 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)完成,通過(guò)在Lnc2Cancer 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“CASC9”并選擇肺鱗癌“LUSC”則可獲得CASC9在肺腺癌患者不同階段的表達(dá)。

利用lncbase和starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CASC9潛在的下游靶基因miRNAs。

通過(guò)在pubmed中搜索癌癥與CASC9的4個(gè)靶基因相關(guān)的文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)miR-195-5p可作為腫瘤抑制因子,因此選擇miR-195-5p作為CASC9的靶基因進(jìn)行研究。

利用miR-pathway數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-195-5p在包括肺腺癌等多種癌癥中的表達(dá)。

miR-195-5p的靶基因由miRDB、miRWalk、TargetScan、starbase和miRTarbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)。

miR-195-5p的靶基因由京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了通路富集分析。

利用GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDK6在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素單方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CASC9在肺鱗癌中高表達(dá)

我們首先通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了CASC9在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá),結(jié)果表明與癌旁正常組織相比,肺鱗癌癌組織中CASC9的表達(dá)明顯升高(見(jiàn)圖1A)。通過(guò)lnc2cancer數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CASC9的表達(dá)與肺鱗癌患者的腫瘤分期呈正相關(guān)(見(jiàn)圖1B)。此外,我們利用qRT-PCR檢測(cè)了人正常肺細(xì)胞和肺鱗癌細(xì)胞系中CASC9的表達(dá)量,結(jié)果表明CASC9在癌細(xì)胞的表達(dá)高于正常細(xì)胞(見(jiàn)圖1C)。以上結(jié)果表明CASC9在肺鱗癌中高表達(dá),可能與肺鱗癌的進(jìn)展相關(guān)。

圖1 CASC9在肺鱗癌癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)Figure 1 CASC9 is high expressed in lung squamous cell carcinoma tissues and cells

2.2 干擾CASC9對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺鱗癌細(xì)胞中CASC9的表達(dá)在轉(zhuǎn)染了si-CASC9后明顯降低(見(jiàn)圖2)。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 CASC9的干擾效率Figure 2 The interference efficiency of CASC9

CCK8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),肺鱗癌細(xì)胞中干擾CASC9后,細(xì)胞增殖能力顯著降低(見(jiàn)圖3)。

Transwell實(shí)驗(yàn)表明干擾CASC9后肺鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著的抑制(見(jiàn)圖4)。

2.3 CASC9直接靶向miR-195-5p并調(diào)控其表達(dá)

為了研究CASC9促進(jìn)肺鱗癌進(jìn)展的分子機(jī)制,我們利用lncbase和starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CASC9潛在的下游靶基因miRNAs,在2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)4個(gè)共同存在的潛在靶基因:miR-424-5p,miR-15a-5p,miR-195-5p,miR-15b-5p(見(jiàn)圖5A)。通過(guò)對(duì)4個(gè)miRNAs在癌癥中作用的檢索發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用,因此選擇miR-195-5p作為CASC9的潛在靶基因來(lái)進(jìn)一步研究。圖5B為CASC9和miR-195-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合位點(diǎn)的突變序列。同時(shí),利用miR-pathway數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),miR-195-5p在NSCLS的兩個(gè)重要亞型肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照(見(jiàn)圖5C)。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 CASC9對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 The effect of CASC9 on the proliferation of LUAD cells

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 干擾CASC9對(duì)肺鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響Figure 4 The effect of CASC9 knockdown on the migration and invasion of LUAD cells

圖5 CASC9靶向miR-195-5pFigure 5 CASC9 targets miR-195-5p

我們通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌細(xì)胞系中miR-195-5p呈低表達(dá)(見(jiàn)圖6A),表明miR-195-5p可能發(fā)揮抑制肺鱗癌的作用。為了證實(shí)CASC9與miR-195-5p之間的靶向關(guān)系,我們將具有與miR-195-5p結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合位點(diǎn)突變的CASC9報(bào)告質(zhì)粒(WT和MUT)與miR-195-5p mimics進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT報(bào)告質(zhì)粒處理組中熒光素酶活性顯著低于MUT組(見(jiàn)圖6B),表明CASC9可直接靶向miR-195-5p。通過(guò)對(duì)肺鱗癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics和si-CASC9,并利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)miR-195-5p和CASC9呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系(見(jiàn)圖6C,D)。因此,上述結(jié)果表明肺鱗癌中CASC9可直接靶向miR-195-5p并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

圖6 CASC9靶向并調(diào)控miR-195-5p的表達(dá)Figure 6 CASC9 targets and regulates the expression of miR-195-5p

2.4 miR-195-5p靶向CDK6

我們通過(guò)miRDB、miRWalk、TargetScan、starbase和miRTarbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了miR-195-5p的潛在靶基因,發(fā)現(xiàn)23個(gè)靶基因共同出現(xiàn)在5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中(見(jiàn)圖7A)。我們將此23個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)CDK6與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)(見(jiàn)圖7B)。通過(guò)對(duì)GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn),CDK6在肺鱗癌癌組織中明顯高表達(dá)(見(jiàn)圖7C,D)。此外,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-195-5p mimics可明顯降低CDK6-WT組細(xì)胞的熒光活性(見(jiàn)圖7E)。

圖7 miR-195-5p靶向CDK6Figure 7 miR-195-5p targets CDK6

2.5 CASC9/miR-195-5p調(diào)控CDK6的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明CDK6在肺鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞(見(jiàn)圖8A)。隨后,Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-195-5p后CDK6的表達(dá)顯著被抑制(見(jiàn)圖8B)。而肺鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CASC9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照NC后,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)CASC9可明顯促進(jìn)CDK6的表達(dá)(見(jiàn)圖8C)。

圖8 CASC9/miR-195-5p調(diào)控CDK6的表達(dá)Figure 8 CASC9/miR-195-5p regulates the expression of CDK6

2.6 CASC9/miR-195-5p調(diào)控CDK6介導(dǎo)的細(xì)胞增殖

CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾CDK6后細(xì)胞增殖能力明顯減弱(見(jiàn)圖9)。而營(yíng)救實(shí)驗(yàn)表明,將miR-195-5p inhibitor或CASC9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與si-CDK6共轉(zhuǎn)染到肺鱗癌細(xì)胞后,敲低CDK6對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制作用顯著被逆轉(zhuǎn)(見(jiàn)圖9)。這些結(jié)果表明CASC9/miR-195-5p通過(guò)介導(dǎo)CDK6調(diào)控癌細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)肺鱗癌的進(jìn)展。

圖9 CASC9/miR-195-5p調(diào)控CDK6介導(dǎo)的細(xì)胞增殖Figure 9 CASC9/miR-195-5p regulates CDK6-mediated cell proliferation

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肺鱗癌作為常見(jiàn)的人類惡性腫瘤之一,目前對(duì)于其發(fā)病機(jī)制還未完全闡明。因此,有待進(jìn)一步研究其內(nèi)在致病相關(guān)的分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道,lncRNA CASC9在多種癌癥中通過(guò)發(fā)揮促癌基因的作用促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。例如,CASC9在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá),CASC9的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān),并且CASC9通過(guò)CPSF3-TGFβ2信號(hào)途徑調(diào)控癌癥的進(jìn)展[10]。此外,最近的研究表明CASC9在膀胱癌中的表達(dá)顯著上調(diào),且與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和患者預(yù)后有關(guān),沉默CASC9可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和膀胱癌的轉(zhuǎn)移;而在分子機(jī)制上,CASC9通過(guò)正向調(diào)控FZD6的表達(dá)并激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑,從而發(fā)揮促進(jìn)膀胱癌的作用[11]。在本研究中,我們通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CASC9在肺鱗癌癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào),表明CASC9可能發(fā)揮促進(jìn)肺鱗癌進(jìn)展的作用。因此我們通過(guò)干擾CASC9來(lái)研究其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞表型的影響。結(jié)果表明干擾CASC9可明顯抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

lncRNA調(diào)控腫瘤進(jìn)展的一種重要模式是通過(guò)充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)[12]。例如,LINC01133通過(guò)靶向miR-106a-3p調(diào)控APC表達(dá)和Wnt/β-catenin信號(hào)途徑來(lái)抑制胃癌的進(jìn)展[13]。在卵巢癌中,lncRNA PTAR可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-101-3p上調(diào)ZEB1的表達(dá),進(jìn)而加速卵巢癌的EMT過(guò)程和轉(zhuǎn)移的發(fā)生[14]。此外,lncRNA CDC6通過(guò)吸附microRNA-215而介導(dǎo)乳腺癌中CDC6的表達(dá),因此促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[15]。lnc00511在肺鱗癌中表達(dá)的升高與腫瘤分期相關(guān),且通過(guò)抑制miR-150-5p和激活TADA1促進(jìn)肺鱗癌的增殖和遷移[16]。為了研究CASC9在肺鱗癌中的作用機(jī)制,我們通過(guò)生物信息學(xué)的分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-195-5p可作為CASC9的靶基因,其表達(dá)在肺鱗癌癌組織和細(xì)胞系中均降低,說(shuō)明miR-195-5p在肺鱗癌中可能發(fā)揮抑癌的作用。同時(shí),miR-195-5p與CASC9的表達(dá)呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系。在本研究中,我們同樣探討了CASC9是否通過(guò)ceRNA的模式影響癌細(xì)胞的表型。我們首先通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)CDK6可能是miR-195-5p的潛在下游靶基因。已有研究發(fā)現(xiàn)CDK6在膀胱癌、結(jié)腸癌和卵巢癌[17-19]等多種癌癥中高表達(dá)。我們進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-195-5p可直接靶向CDK6。本研究發(fā)現(xiàn),作為促癌基因,CDK6在肺鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)均升高。此外,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-195-5p可抑制CDK6的表達(dá),而過(guò)表達(dá)CASC9可明顯上調(diào)CDK6的表達(dá)。結(jié)合干擾CASC9后miR-195-5p表達(dá)升高的結(jié)果,本研究說(shuō)明CASC9以ceRNA的模式影響了肺鱗癌的進(jìn)展,即CASC9通過(guò)靶向miR-195-5p/CDK6信號(hào)軸調(diào)控肺鱗癌的進(jìn)展。

總之,我們的研究表明CASC9在肺鱗癌中呈高表達(dá),且CASC9的表達(dá)與肺鱗癌患者的腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)。分子機(jī)制研究表明CASC9通過(guò)靶向抑制miR-195-5p上調(diào)癌基因CDK6的表達(dá)。因此,本研究結(jié)果表明CASC9/miR-195-5p/CDK6信號(hào)通路可能是肺鱗癌診斷或治療的潛在分子靶點(diǎn)。