李 瑞，張旺東，李建飛，火興民，張 睿，劉曉霞，李沛軒，謝 飛，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

近些年隨著對腸道微生物多樣性及其功能的研究，發(fā)現(xiàn)腸道微生物在人類和動物的胃腸道內(nèi)扮演著重要的角色[1]。微生物學(xué)研究表明胃腸道乳酸菌在維持腸道健康起著關(guān)鍵性的作用[1-2]。其在腸道內(nèi)的組成變化與糖尿病、肥胖、癌癥等有著密不可分的聯(lián)系[2-4]。乳酸菌是一類能利用碳水化合、脂類、氨基酸、蛋白質(zhì)等進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性菌，其對人畜健康的益處除其自身組成物質(zhì)外也包括其在代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，例如肽聚糖、多糖、細(xì)菌素、過氧化氫、乳酸等代謝產(chǎn)物[5-7]。其中乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸不僅通過降低pH來抑制有害菌的生長繁殖，而且還可以通過對革蘭氏陰性菌如大腸埃希氏菌等進(jìn)行滲透作用來阻止它們對腸道的侵襲以減輕腸道黏膜的損傷[8]。近些年隨著對抗生素的濫用和誤用使得耐藥細(xì)菌和耐藥基因快速出現(xiàn)，從而降低了抗生素對人和動物病原體的治療潛力也對環(huán)境造成了威脅，殘留在環(huán)境中的抗生素不僅對環(huán)境系統(tǒng)產(chǎn)生了破壞，更對生態(tài)系統(tǒng)中的人和動物健康造成了威脅[9]。乳酸菌通過對碳水化物進(jìn)行發(fā)酵主要產(chǎn)生乳酸，除了可用于生物降解聚合物的合成外，還可以作為未來綠色化學(xué)的原料[10]。

棲息在干旱的荒漠和半荒漠地區(qū)的阿拉爾善雙峰駝具有多種經(jīng)濟性狀和生產(chǎn)性的畜種。駝絨是最好的紡織原料[11]、駝肉是低脂高蛋白的天然綠色食品、駝奶營養(yǎng)豐富，脂肪球小易消化吸收，可開發(fā)為綠色保健飲品[12]。作為一個古老的原始品種，在進(jìn)化過程中形成了許多獨特的適應(yīng)荒漠草原的生物學(xué)特性。被譽為沙漠之舟的雙峰駝喜食白沙蒿、鰭薊、沙蓬、梭梭、駝絨藜、白刺等植物，生活在極其惡劣環(huán)境下的雙峰駝形成了獨特的生理功能，如解毒、耐饑渴、耐干旱、耐熱、耐寒等特性[13-14]。雙峰駝與其他動物在胃的結(jié)構(gòu)上存在著區(qū)別，例如牛和綿羊等反芻動物有瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃，但雙峰駝卻沒有瓣胃。研究表明對于大型食草動物而言，食物在駱駝前胃的停滯時間相對較長，因此乳酸菌對胃內(nèi)的特殊環(huán)境的耐受力要高于其他反芻動物，尤其是對胃酸的耐受力[15-16]。乳酸菌在人和動物胃腸道內(nèi)黏附和定殖是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。因此乳酸菌必須耐受胃腸道的特殊環(huán)境并定殖與腸道黏膜表面，可通過分泌抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)來競爭腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)與位置阻止病原菌在腸道內(nèi)定殖，起到保護和維持腸道平衡來維護胃腸道功能健康的重要作用17。本試驗通過對雙峰駝十二指腸乳酸菌的分離與鑒定來摸索其生理特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 源于民勤健康雙峰駝(阿拉善駝種)壯齡駝(6歲～16歲)。組織樣品采自屠宰場，頸動脈放血致死前，靜脈注射戊巴比妥鈉(20 mg/kg)使其麻醉，迅速開腹取長約10 cm的十二指腸兩端用棉線繩扎緊，放入液氮內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 MRS培養(yǎng)基，革蘭氏染色試劑盒，氧化酶試紙，七葉苷，不同糖類生化發(fā)酵管，標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙片，2×TaqPCR Master Mix，細(xì)菌DNA提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 對采集的新鮮雙峰駝十二指腸在超凈工作臺中無菌操作，用滅菌后的剪刀迅速剪開腸管，用無菌生理鹽水沖洗腸道，洗去其內(nèi)容物，用無菌載玻片刮取腸道黏膜放入裝入MRS液體培養(yǎng)基的試管中。

1.2.2 細(xì)菌的分離鑒定 將樣品分別平鋪于含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，在37 ℃瓊培養(yǎng)24 h。隨后在培養(yǎng)24 h后的固體培養(yǎng)基上挑取單個含有溶鈣圈的菌落，將其接種于含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行反復(fù)劃線直至革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為純菌株的革蘭氏染色陽性菌。將純菌株與甘油(1∶1)混合保存至-80℃超低溫冰箱中。

1.2.3 乳酸菌的生化與16S鑒定 參照文獻(xiàn)[5-7]將挑選出的純菌株進(jìn)行過氧化氫酶的測定、氧化酶的測定、葡萄糖產(chǎn)酸試驗、明膠液化、碳酸化合物發(fā)酵等生理生化試驗。將疑似菌株進(jìn)行16S rRAN鑒定：利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA，然后采用 16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴增以提取的基因組DNA為模板擴增16S rRNA，引物為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′；PCR反應(yīng)體系為：25 μL mix，上、下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補足至50 μL；PCR程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,將擴增成功后的PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測序，其結(jié)果在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，并分析鑒定菌株的同源性。利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 乳酸菌生長曲線和pH的測定 將鑒定出的純菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔4 h取樣測其OD 600 nm的值，持續(xù)至24 h。每個樣品重復(fù)3次取其平均值，將獲得的數(shù)據(jù)繪制生長曲線。將-80 ℃保存的純菌株活化2代后，接種至MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)，用pHS-3B精密酸度計測量不同時間段菌液的pH，每個樣品做3次重復(fù)，將記錄的數(shù)據(jù)繪制曲線。

1.2.5 乳酸菌耐酸實驗 以pH 7.0的PBS緩沖液為基礎(chǔ)，使用370 g/L鹽酸將其調(diào)制為3.0，滅菌后按100 mL/L的接種量接入已活化2代的菌液，在37 ℃條件下分別取0、30、60、90、120 min通過平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，每組3個平行并取其平均數(shù)。

1.2.6 乳酸菌藥敏試驗 將培養(yǎng)24 h的乳酸菌液稀釋至合適濃度后，取100 μL均勻涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，使用無菌鑷子將不同的藥敏片均勻的貼在培養(yǎng)基表面，每個平板放入4種抗生素藥敏片。至于37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h～24 h，觀察其耐藥結(jié)果，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。每組做3個重復(fù)并通過結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實驗技術(shù)》[7]。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌菌落與染色形態(tài)特征

對雙峰駝十二指腸內(nèi)分離出的4株乳酸菌革蘭氏染色結(jié)果顯示,B1、B2、B3、C1染色結(jié)果均為陽性，鏡檢除C1細(xì)菌形態(tài)為圓形外其余3株均為桿狀，但B2的菌落形態(tài)對比其他3株較透明，B3雖然菌落形態(tài)為白色但其表面光滑度較B1、C1粗糙。根據(jù)其菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果及生理生化鑒定結(jié)果參考《細(xì)菌伯杰氏鑒定手冊》初步判斷B1、B2、B3為乳桿菌屬，C1為乳球菌屬。結(jié)果表明不同的菌株其菌落形態(tài)及其細(xì)菌形態(tài)也會存在差異(表1和圖1)。

2.2 乳酸菌生化及16S rRNA PCR擴增鑒定結(jié)果

分離出的4株菌生理生化結(jié)果顯示,4株乳酸菌的氧化酶、過氧化氫、明膠液化、硫化氫試驗均為陰性，但4株菌對甘露糖、山梨醇、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等發(fā)酵結(jié)果為陽性(表2)。結(jié)果表明，這4株菌對葡萄糖、山梨醇、麥芽糖、蔗糖等都能發(fā)酵利用。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行對照分析，初步判定為乳酸菌。

將4株菌的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶結(jié)果顯示，其大小為1 500 bp左右(圖2)。其結(jié)果與16S rRNA基因測序片段結(jié)果一致，將其基因測序結(jié)果通過NCBI的Blast進(jìn)行比對,結(jié)果表明B1菌株與Lactobacilluscrispatus同源性100%、B2菌株與Lactobacillusjohnsonii同源性為100%，B3菌株與Lactobacillussalivarius同源性100%。C1菌株為Pediococcuspentosans同源性為99%。表明B1為卷曲乳桿菌、B2為唾液乳桿菌、B3為約氏乳桿菌、C1(為戊糖片球菌。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

表1 乳酸菌菌落形態(tài)及革蘭氏染色及鏡檢結(jié)果

A～B.戊糖片球菌；C～D.卷曲乳桿菌；E～F.唾液乳桿菌；G～H.約氏乳桿菌

表2 乳酸菌生化鑒定結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;B1.卷曲乳桿菌;B2.唾液乳桿菌；B3.約氏乳桿菌;C1.戊糖片球菌

2.3 乳酸菌產(chǎn)酸和生長曲線的繪制

4株菌株的產(chǎn)酸結(jié)果顯示，B1(卷曲乳桿菌)為3.96、B2(唾液乳桿菌)為3.91，B3(約氏乳桿菌)為4.2，C1(戊糖片球菌)為3.42。結(jié)果表明，D為戊糖片球菌，產(chǎn)酸程度較其他3株菌的產(chǎn)酸能力較強，其次唾液乳桿菌產(chǎn)酸程度次于戊糖片球菌,約氏乳桿菌產(chǎn)酸能力最差。卷曲乳桿菌在4 h～20 h處于對數(shù)生長，20 h之后從對數(shù)期處于穩(wěn)定期的改變；唾液乳桿菌從4 h～18 h處于對數(shù)生長期，18 h之后處于穩(wěn)定生長期；約氏乳桿菌從4 h之后開始到20 h處于對數(shù)生長期，20 h之后處于穩(wěn)定生長期；戊糖片球菌從4 h～18 h處于對數(shù)生長期，18 h之后處于穩(wěn)定期。表明4株菌株的最佳培養(yǎng)時間均為12 h～16 h之間。如圖4所示，4株菌隨著培養(yǎng)時間的增長產(chǎn)酸量增加，到最適生長時間時其產(chǎn)酸量最低。

A.卷曲乳桿菌;B.唾液乳桿菌；C.約氏乳桿菌；D.戊糖片球菌

A.卷曲乳桿菌;B.唾液乳桿菌；C.約氏乳桿菌；D.戊糖片球菌

2.4 乳酸菌耐酸試驗

一般把能在pH 3.0環(huán)境下存在120 min作為體外初步篩選的初步條件。結(jié)果顯示，只有戊糖片球菌、卷曲乳桿菌和唾液乳桿菌在pH 3.0的環(huán)境下120 min能存活，約氏乳桿菌在pH 3.0環(huán)境下，在30 min的時活菌數(shù)增加，到60 min的時活菌數(shù)顯著下降，90 min和120 min時活菌數(shù)為0。表明了卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌和戊糖片球菌對酸性環(huán)境的耐受性要高于約氏乳桿菌。

2.5 乳酸菌耐膽鹽試驗

乳酸菌在腸道內(nèi)發(fā)揮其作用除受胃酸影響其存活外，腸道內(nèi)膽鹽也能改變其外膜通透性，所以其對腸道膽汁也應(yīng)存在一定的耐受性。結(jié)果表明膽鹽濃度>5 mg/mL時對4株菌的存活率影響較強，卷曲乳桿菌對膽鹽的耐受性最強。其次為戊糖片球菌，唾液乳桿菌對膽鹽的耐受性最弱。約氏乳桿菌對膽鹽的耐受力最弱，其對酸的耐受力也最差(圖5)。

2.6 乳酸菌對抗生素的耐藥性

通過K-B紙片瓊脂擴散法測量藥紙片抑菌圈直徑大小，依據(jù)《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究》中的耐藥實驗中的判定標(biāo)準(zhǔn)，卷曲乳桿菌對四環(huán)素、青霉素、萬古霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素、鏈霉素表現(xiàn)出耐藥，對紅霉素呈現(xiàn)在耐藥和敏感之間，對氯霉素、氨芐西林敏感；唾液乳桿菌對氯霉素和青霉素敏感，鏈霉素處于敏感和耐藥之間，而對四環(huán)素、紅霉素、利福平、萬古霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素耐藥；約氏乳桿菌對紅霉素敏感，四環(huán)素、氨芐西林、萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素呈現(xiàn)耐藥，而對氨芐西林、利福平處于耐藥和敏感之間；戊糖片球菌對四環(huán)素、青霉素、利福平、慶大霉素和鏈霉素耐藥，紅霉素、氯霉素敏感，而對氨芐西林、萬古霉素呈現(xiàn)中介(圖6)。

3 討論

乳酸菌與人畜胃腸道內(nèi)疾病有著緊密的聯(lián)系并對腸道疾病防御起著關(guān)鍵的作用，在疾病診斷方面能夠利用腸道微生物群作為生物標(biāo)志物來檢測腸道疾病[18]。腸道菌群也被提出作為代謝紊亂的治療靶標(biāo)[19]。但是乳酸菌對腸道功能健全的維護必須要具有耐酸耐膽鹽能力，雙峰駝對比其他反芻動物沒有瓣胃意味著食物在胃內(nèi)儲存的時間要高于其他哺乳動物，對胃酸的耐受性強[15-16]，本試驗從雙峰駝腸道內(nèi)分離出唾液乳桿菌、約氏乳桿菌、戊糖小片球菌和卷曲乳桿菌這4株菌株，試驗結(jié)果表明，這4株菌中卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌、戊糖片球菌對鹽酸的耐受能力強，能在pH 3.0的環(huán)境中耐受120 min,但約氏乳桿菌對鹽酸的耐受能力低于其余3種菌株，在90 min和120 min的環(huán)境中菌株不存活。乳酸菌在腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用，除了耐受胃內(nèi)嚴(yán)酷的酸性環(huán)境外，還必須要承受膽鹽的侵襲作用[20]。試驗結(jié)果表明，卷曲乳桿菌對膽鹽的耐受性強于其余3株菌，約氏乳桿菌對膽鹽的耐受性最弱。乳酸菌經(jīng)受胃酸和膽鹽的特殊環(huán)境后才能在腸道發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防有害菌對腸道的損傷。通過耐酸、耐膽鹽試驗，結(jié)果表明卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌和戊糖片球菌對胃酸和膽鹽具有較好的耐受性，能夠作為治療腸道疾病的輔助藥物的候選者。但隨著近些年對抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌菌株的出現(xiàn)，乳酸菌對抗生素的耐藥作用是其成為新型治療胃腸道疾病藥物的關(guān)鍵因素。經(jīng)對試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，不同菌株表現(xiàn)出不同的耐藥性，4株菌均對四環(huán)素、慶大霉素產(chǎn)生耐藥性；卷曲乳桿菌對紅霉素處于中介，唾液乳桿菌對紅霉素表現(xiàn)為耐藥，其余2株均為敏感狀態(tài)；對氯霉素卷曲乳桿菌、唾液乳桿菌和戊糖片球菌均表現(xiàn)為敏感，但約氏乳桿菌卻處于中介；除了唾液乳桿菌對青霉素表現(xiàn)出敏感之外其余3種菌對其耐藥；約氏乳桿菌對利福平呈現(xiàn)中介，其余3株菌均為耐藥表現(xiàn)；除戊糖片球菌對萬古霉素處于中介，其余呈現(xiàn)耐藥；卷曲乳桿菌和唾液乳桿菌對復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性，約氏乳桿菌和戊糖片球菌處于中介；卷曲乳桿菌、約氏乳桿菌和戊糖片球菌對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性，唾液乳桿菌卻對其處于中介。因此可以表明菌種的不同，可能會對受體以及藥物的耐受性有著不一致的結(jié)果。

A.卷曲乳桿菌;B.唾液乳桿菌；C.約氏乳桿菌；D.戊糖片球菌

A.卷曲乳桿菌;B.唾液乳桿菌；C.約氏乳桿菌；D.戊糖片球菌；1.四環(huán)素;2.紅霉素;3.氯霉素;4.氨芐西林;5.青霉素;6.利福平;7.萬古霉素;8.復(fù)方新諾明;9.慶大霉素;10.鏈霉素

本試驗從雙峰駝十二指腸內(nèi)分離出的唾液乳桿菌能夠刺激免疫系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)Th1型過敏反應(yīng)，來改善其過敏癥狀[21]。約氏乳桿菌有改善肥胖、減少膽固醇等功能[22]。本試驗通過對雙峰駝十二指腸腸道內(nèi)乳酸菌的分離鑒定，為乳酸菌對胃腸道黏膜有益作用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。