李 睿，喬松林，張改平

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱(chēng)豬藍(lán)耳病，臨床癥狀為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬呼吸道疾病等[1]。PRRS病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒[2]，危害巨大，多年來(lái)一直是獸醫(yī)和病毒學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。然而，由于PRRSV具有獨(dú)特而且復(fù)雜的感染機(jī)制，目前對(duì)其防控并未取得顯著效果[3]。作為具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主細(xì)胞需進(jìn)行病毒囊膜與宿主細(xì)胞靶膜融合(membrane fusion)這一關(guān)鍵步驟。因此，追蹤PRRSV膜融合最新研究進(jìn)展將為深入理解PRRSV致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為防控PRRS提供新的思路和策略。

1 囊膜病毒及其膜融合機(jī)制

囊膜病毒(enveloped viruses)是一類(lèi)在由核酸(DNA或RNA)和蛋白質(zhì)外殼(capsid)組成的核衣殼(nucleocapsid)外具有脂質(zhì)雙分子層囊膜結(jié)構(gòu)(envelope)的病毒[4]。因缺乏復(fù)制必需的基本系統(tǒng)，病毒自身不能增殖，必須感染宿主細(xì)胞，將核酸侵入宿主細(xì)胞內(nèi)借助宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)增殖新的病毒從而進(jìn)行傳播[5]。囊膜病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵步驟是病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜(plasma membrane)或胞內(nèi)體(endosomes)膜等靶膜的融合[6]。這一過(guò)程是由病毒膜融合蛋白(fusion protein)介導(dǎo)，宿主細(xì)胞受體結(jié)合、低pH刺激、蛋白酶切割等誘導(dǎo)和激發(fā)的復(fù)雜過(guò)程[7]。根據(jù)囊膜病毒膜融合蛋白在囊膜表面的結(jié)構(gòu)、排列及膜融合時(shí)構(gòu)象變化等的不同，目前可將囊膜病毒膜融合蛋白分為3類(lèi)，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[8]。Ⅰ型膜融合蛋白，以副流感病毒(Parainfluenza virus)為例，富含α-螺旋結(jié)構(gòu)(α-helix)，在電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的“纖突”或“刺突”，具有融合肽(fusion peptide)，膜融合完成后變構(gòu)形成穩(wěn)定折疊的三聚體發(fā)夾結(jié)構(gòu)(trimer-of-hairpins)；Ⅱ型膜融合蛋白，以蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)為例，富含β-片層結(jié)構(gòu)(β-sheet)卻不形成“纖突”或“刺突”，具有融合環(huán)(fusion loop)，但最終膜融合完成后仍會(huì)形成三聚體發(fā)夾結(jié)構(gòu)；Ⅲ型膜融合蛋白，以水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)為例，兼具α-螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)，目前這類(lèi)病毒膜融蛋白研究還不全面[9]。

研究囊膜病毒膜融合機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值，針對(duì)病毒膜融合蛋白可制備高效特異性疫苗或針對(duì)病毒膜融合過(guò)程研發(fā)新型抗體類(lèi)和小分子類(lèi)抗病毒藥物等[10-11]。例如，根據(jù)人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)膜融合蛋白設(shè)計(jì)的多肽類(lèi)抑制藥物恩夫韋肽(enfuvirtide)已獲得美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療并取得了顯著的抑制病毒感染效果[12]。近期，復(fù)旦大學(xué)陸路/姜世勃等發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)膜融合抑制劑針對(duì)新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)治療具有較好的臨床應(yīng)用前景[13]。

2 PRRSV與膜融合

PRRS于20世紀(jì)80年代末90年代初分別在美洲和歐洲報(bào)道[14]。自此該病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，目前已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。據(jù)估計(jì)PRRS每年給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成近6.5億美元的經(jīng)濟(jì)損失[15]。自1995年我國(guó)首次報(bào)道PRRS以來(lái)，該病在國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期流行[16]?？紤]到國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖水平，PRRS對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失應(yīng)遠(yuǎn)大于美國(guó)。特別是2006年，我國(guó)大面積暴發(fā)和流行的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了前所未有的打擊[17-18]。從2013年起，由NADC30樣(NADC30-like)毒株引起的PRRS在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)并廣泛流行，引發(fā)了新的關(guān)注[19-21]。

PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)動(dòng)脈炎病毒屬(Porartevirus)[22-23]。PRRSV分離毒株分為2個(gè)基因型，即PRRSV-1和PRRSV-2[24]。PRRSV基因組約15 kb，含有至少10個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames，ORFs)[22]。其中，ORF1(ORF1a和ORF1ab)編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶等非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins，Nsps)；ORF5-7分別編碼囊膜糖蛋白(glycoprotein，GP)GP5、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)，它們是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a分別編碼囊膜糖蛋白GP2a、GP2b(又稱(chēng)E)、GP3、GP4 和GP5a，它們是PRRSV的次要結(jié)構(gòu)蛋白[25]。GP5、M、GP2a、GP2b、GP3、GP4 和GP5a分布在PRRSV囊膜表面[26]。

豬是PRRSV目前唯一已知的宿主，PRRSV在豬體內(nèi)主要感染單核/巨噬細(xì)胞，如豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)[27]。PRRSV在體外還感染非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系MA-104及其衍生的MARC-145細(xì)胞系等[28]。研究證實(shí)PRRSV是由宿主細(xì)胞表面必需受體CD163介導(dǎo)，通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞途徑(clathrin-mediated endocytosis，CME)入侵宿主細(xì)胞的[29-33]。作為一種具有囊膜的病毒，PRRSV感染宿主細(xì)胞需進(jìn)行膜融合這一關(guān)鍵步驟。但是，目前國(guó)內(nèi)外在PRRSV膜融合機(jī)制研究領(lǐng)域存在很多空白，包括病毒必需受體CD163在PRRSV 膜融合過(guò)程中的具體作用機(jī)理，除必需受體CD163外是否還存在其他宿主因子(如低pH、蛋白酶)甚至是輔助受體參與PRRSV膜融合及其作用細(xì)節(jié)，在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中參與膜融合的囊膜蛋白是哪個(gè)(些)及其參與膜融合詳細(xì)機(jī)制等。這些問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了人們對(duì)PRRSV致病機(jī)理的全面認(rèn)識(shí)及對(duì)PRRS的有效防控。

3 PRRSV膜融合機(jī)制最新研究進(jìn)展

近年來(lái)，隨著研究深入，國(guó)內(nèi)學(xué)者率先在PRRSV膜融合領(lǐng)域取得進(jìn)展。

2019年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授、韓軍教授研究團(tuán)隊(duì)利用親脂性染料R18標(biāo)記HP-PRRSV毒株JXwn06及其缺失突變株，通過(guò)激光共聚焦顯微術(shù)(laser confocal microscopy，LCM)發(fā)現(xiàn)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2高變區(qū)(hypervariable region)323-521位氨基酸缺失影響了PRRSV膜融合，揭示了該蛋白在PRRSV感染中的新功能[34]。

本研究團(tuán)隊(duì)近期利用病毒囊膜親脂性染料DiD標(biāo)記PRRSV-2經(jīng)典毒株BJ-4通過(guò)LCM監(jiān)測(cè)到PRRSV在感染MARC-145細(xì)胞和PAMs早期(45 min)發(fā)生膜融合；然后利用亞細(xì)胞定位標(biāo)志物證實(shí)PRRSV在以Ras相關(guān)蛋白11(Ras-related protein 11，Rab11)為標(biāo)志的循環(huán)胞內(nèi)體(recycling endosomes)發(fā)生膜融合；進(jìn)一步通過(guò)顯性失活/組成型激活(dominant negative/constitutive active，DN/CA)突變體、特異性抑制劑(inhibitors)、RNA干擾(RNA interferece，RNAi)等驗(yàn)證Rab11-recycling endosomes中低pH和組織蛋白酶E(cathepsin E)在PRRSV膜融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)(real-time PCR，PCR)測(cè)定PRRSV ORF7復(fù)制、蛋白印跡法(Western blot，WB)測(cè)定PRRSV N蛋白翻譯、病毒滴度試驗(yàn)(50% tissue culture infectious dose，TCID50)測(cè)定PRRSV子代病毒等證實(shí)阻礙PRRSV膜融合過(guò)程會(huì)影響病毒感染；最后經(jīng)病毒蛋白特異性抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSV膜融合過(guò)程中其囊膜糖蛋白GP5被cathepsin E切割[35]。這一研究在國(guó)內(nèi)外首次揭示了PRRSV膜融合細(xì)節(jié)，加深了人們對(duì)PRRSV致病機(jī)制的理解；更重要的是，該研究鑒定出的低pH、cathepsin E、GP5可作為抗PRRSV藥物和疫苗的新靶標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者在PRRSV膜融合機(jī)制取得了研究進(jìn)展，但是PRRSV膜融合領(lǐng)域仍存在許多空白值得深入研究：病毒必需受體CD163在PRRSV膜融合過(guò)程中的具體作用機(jī)制;除Rab11、低pH、cathepsin E外是否還存在其他宿主因子參與PRRSV膜融合及其作用機(jī)理;PRRSV GP5蛋白是否作為病毒膜融合蛋白等?；谝讶〉玫倪M(jìn)展，持續(xù)深入研究PRRSV膜融合機(jī)制將為防控該病毒提供新的思路和策略，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。