劉 暢，楊琳燕，王藝霞，張 偉，李道穩(wěn)，李留安，李 存

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392)

免疫層析技術(shù)(immunochromatographic analysis，ICA)始于20世紀(jì)后期，是一種將色譜層析和免疫技術(shù)相結(jié)合的快速檢測技術(shù)[1]。由于檢測周期短、成本低、對儀器設(shè)備和人員沒有特殊要求，ICA在即時檢測(point-of-care testing,POCT)方面發(fā)揮著不可替代的作用，發(fā)展前景廣闊，其中最經(jīng)典的一種標(biāo)記檢測技術(shù)是膠體金ICA[2]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展和新材料的應(yīng)用，ICA技術(shù)不斷創(chuàng)新變革，將具有更廣泛的應(yīng)用范圍和更廣闊的開發(fā)前景。

1 ICA技術(shù)簡介

1.1 ICA技術(shù)原理

以膠體金為例，ICA以膠體金標(biāo)記抗原或抗體，層析過程中，膠體金標(biāo)記物隨樣品溶液通過毛細(xì)作用在試紙條上移動，與測試線(test line,T線)上相應(yīng)的受體結(jié)合，聚集后顯紅棕色[3]。T線的顏色深淺反映了樣品中待測物的含量。同時設(shè)質(zhì)控線(control line,C線)，驗證檢測結(jié)果是否有效。

根據(jù)待測分子的大小和結(jié)合方式，ICA可分為夾心法和競爭法[2]。夾心法是指待測抗原的不同表位分別與兩種抗體結(jié)合，在試紙條上形成抗體1-抗原-抗體2夾心結(jié)構(gòu)[4]，適用于大分子待測物。競爭法一般用于小分子，T線用待測抗原或抗原類似物處理，它與待測物競爭結(jié)合標(biāo)記抗體，所以T線顏色強度與待測物的含量成反比[5]。

1.2 ICA的發(fā)展趨勢

1.2.1 靈敏度提高 高靈敏度、定量檢測和多元檢測是ICA技術(shù)的發(fā)展趨勢[6]。免疫標(biāo)記材料是影響靈敏度的一個重要因素。膠體金是應(yīng)用最早、應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記材料，但靈敏度偏低[7]。量子點(quantum dot,QD)[8]、時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)[9]以及磁性微球(magnetic bead,MB)[10]等新型標(biāo)記材料的出現(xiàn)使得ICA的靈敏度不斷提高。Lu T等[11]以膠體金和QD作為信號標(biāo)簽，分別建立了兩種檢測Ⅱ型志賀毒素的ICA方法，膠體金ICA的檢測限為25 ng/mL，QD ICA方法為5 ng/mL，靈敏度明顯高于膠體金方法。

生物素-親和素系統(tǒng)(biotin avidin system，BAS)[12]、貴金屬[13]、脂質(zhì)體[4]等信號放大系統(tǒng)的應(yīng)用也對ICA技術(shù)靈敏度的提高起到了積極作用。BAS親和力極強，有信號放大作用，可與蛋白等生物分子結(jié)合而不破壞其活性。Serebrennikova K V等[12]依靠BAS提高了膠體金ICA的靈敏度，其靈敏度比常規(guī)膠體金方法提高了4倍。Anfossi L等[8]制備了CdSe QD，以金、銀納米粒子作為淬滅劑，建立了檢測玉米粉中伏馬菌素的ICA方法。通過淬滅劑的作用，熒光信號隨伏馬菌素的含量成倍變化，檢測限范圍在1.56 ng/mL～6.25 ng/mL之間，比普通方法低4倍。

1.2.2 半定量、定量檢測 ICA的半定量、定量方法也在逐步發(fā)展。Serebrennikova K V等[14]同時用3個不同濃度的金標(biāo)抗體包被試紙條T區(qū)，制成多范圍梯度的ICA，可快速實現(xiàn)降鈣素原的半定量測定。Zhang X等[15]分別將赭曲毒素A(ochratoxin，OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)的結(jié)合抗原噴涂在NC膜上，建立膠體金ICA方法，借助便攜式讀卡器能夠同時對玉米、小麥和飼料中的OTA、ZEN進行定量。Han M M等[16]構(gòu)建了可同時檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)、三聚氰胺以及6種抗生素的膠體金檢測卡，拍照后用Image J軟件分析能夠得到半定量結(jié)果。Li X M等[17]開發(fā)了一個Android應(yīng)用程序，可以快速定量玉米和飼料中ZEN的ICA分析結(jié)果，并且支持檢測結(jié)果共享。熒光定量閱讀器[18]、磁信號閱讀[19]等儀器可用于量化檢測結(jié)果，自動化程度高，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確。

1.2.3 層析材料的變化 常用的ICA常用聚酯纖維、玻璃纖維、尼龍膜等作為固定材料，現(xiàn)在的固定材料以硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)居多。NC膜對生物大分子的吸附性強[4]，性質(zhì)穩(wěn)定，便于保存；親水性好，樣品溶液可以在膜上快速層析，從而實現(xiàn)快速檢測。有些公司已經(jīng)開發(fā)一體化材料，同時作為樣品墊、結(jié)合墊、固定膜和吸水墊，推動免疫層析技術(shù)朝著更加簡便的方向發(fā)展。

2 ICA標(biāo)記材料的分類

2.1 膠體金

膠體金是用氯金酸溶液制成的穩(wěn)定的膠體溶液。膠體金技術(shù)的原理是用膠體金為標(biāo)記材料，隨著抗原抗體反應(yīng)的進行，膠體金在NC膜的T線集聚并顯出紅棕色[3]。具有操作簡便、迅速，不依賴任何儀器的特點。然而，由于靈敏度不夠理想，膠體金法一般用于對目標(biāo)物的初篩檢測。Serebrennikova K V等[14]在傳統(tǒng)膠體金方法的基礎(chǔ)上進行改進，制得直徑為100 nm的納米金花并將其用于ICA，方法的靈敏度提高了5倍。Zeng Y Y等[20]用生物素和鏈霉親和素對金納米顆粒進行雙標(biāo)記，構(gòu)建了一種帶有熒光背景阻斷的新型膠體金ICA方法。該方法對于豬尿液中克侖特羅的檢測限為0.03 μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金方法提高了60倍。

2.2 熒光標(biāo)記材料

熒光ICA是以熒光材料標(biāo)記抗原或抗體，待測物與之結(jié)合后形成帶有熒光標(biāo)記的免疫復(fù)合物，通過測定免疫復(fù)合物的熒光含量即可推算待測物的濃度。熒光ICA方法的背景干擾小，靈敏度高；缺點是檢測結(jié)果肉眼不可見，需要與相關(guān)儀器聯(lián)用，而且熒光存在自然淬滅現(xiàn)象，保存成本較高[11]。

2.2.1 量子點 量子點(QD)主要由ⅡB族～ⅥA族或ⅢA族～ⅤA族元素構(gòu)成，是能夠產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒[21]。QD具有優(yōu)良的標(biāo)記特性和光化學(xué)穩(wěn)定性，激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄，熒光強度高[22]，是一種很好的標(biāo)記材料。Huang Z等[23]針對豬尿液中的克侖特羅，在磁珠表面組裝QD，在此基礎(chǔ)上建立了一種靈敏度高、耐基質(zhì)干擾的克侖特羅ICA檢測方法。QD可單獨作為一種標(biāo)記材料，與MNP材料同時使用能夠簡化制備過程，同時結(jié)果判定方式變得多樣化。Xie S L等[18]使用不同的CdSe/ZnS QD建立了一種能夠同時檢測雞肉中金剛烷胺和氯霉素的定量ICA方法。分析結(jié)果與市售ELISA試劑盒檢測結(jié)果相符，對于金剛烷胺和氯霉素的檢測限分別為0.18 ng/g和0.016 ng/g。

2.2.2 時間分辨熒光微球 時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microsphere,TrFM)由稀土元素構(gòu)成，表面有豐富的官能團可用來偶聯(lián)抗體，Stokes位移大，熒光效率高[24]。Stokes位移是指熒光光譜較相應(yīng)的吸收光譜紅移，是最大熒光發(fā)射波長與最大吸收波長之間的差值。較大的Stokes位移能夠增強熒光材料的抗干擾能力，提高信噪比，有助于提高檢測的靈敏度[25]。Li X M等[9]利用膠體金、乳膠微球和TrFM作為抗體標(biāo)記示蹤劑，分別建立了3種檢測牛奶和豬肉中泰樂菌素和替米考星殘留的ICA方法。其中以TrFM為標(biāo)記物的方法靈敏度高、制備成本較低、抗體消耗量少，有希望用于現(xiàn)場檢測和大批量樣本篩選。

2.2.3 上轉(zhuǎn)換納米顆粒 上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversional nanoparticles,UCNP)由稀土金屬元素?fù)诫s惰性氧化物構(gòu)成，在近紅外光激發(fā)下表現(xiàn)出強熒光[26]，抗光漂白能力強，背景干擾小，發(fā)光壽命長[27]，具有天然材料所不具備的優(yōu)點。但UCNP的量子產(chǎn)率很低，在實際應(yīng)用中受限制[28]。李丹陽等[27]使用磷酸化的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)適配體包裹UCNPs，結(jié)合ICA方法快速定性并定量花生中的AFB1，檢測限為2.4 ng/mL，結(jié)果準(zhǔn)確，具有潛在的實用價值。

2.3 磁性納米顆粒

以Fe3O4為代表的磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNP)是近些年發(fā)展起來的一種新型標(biāo)記物。普通ICA通過T線的顏色強度反映待測物含量，但肉眼或讀卡器只能觀察記錄NC膜表面約10 μm厚度的顏色信號。如果以MNP為ICA的標(biāo)記材料，磁信號閱讀器能夠?qū)φ麄€NC膜上(約150 μm厚)MNPs的磁場進行定量[5]；而且，一般生物樣品中不含磁信號，背景信號低，因此靈敏度更高。MNP也促進了ICA由定性向定量發(fā)展，使檢測過程更加快速、準(zhǔn)確、高效。Mu X H等[19]以MNP為標(biāo)記材料，用磁敏傳感器檢測試紙條上相應(yīng)位置的磁場強度，建立了一種檢測蓖麻毒素的ICA方法，該方法克服了樣品背景色的干擾，檢測限為1 ng/mL，能夠滿足水、土壤和食物等模擬樣品的檢測要求。Wang C等[29]建立了可準(zhǔn)確測定血清中非結(jié)合雌三醇的MNP ICA方法，磁信號穩(wěn)定，結(jié)果與TrFM ICA方法有較好的相關(guān)性。

3 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用

3.1 獸藥殘留檢測

獸藥殘留問題與人體健康和環(huán)境安全息息相關(guān)，雖然我國對獸藥的休藥期和殘留限量作了規(guī)定，但獸藥的不規(guī)范使用、非法濫用現(xiàn)象依然存在。ICA技術(shù)對儀器的依賴性小，數(shù)分鐘內(nèi)即可觀察檢測結(jié)果，適合即時檢驗(point-of-care testing，POCT)和大批量樣本初篩。顧娟紅等[30]制備了金磁復(fù)合微粒，并以此為標(biāo)記物實現(xiàn)對鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的定性、定量檢測。對于二者的檢測限分別為0.25 ng/mL和0.5 ng/mL，特異性良好。金磁復(fù)合微粒兼有MNPs的磁性和納米金的光學(xué)性質(zhì)，檢測結(jié)果既可以眼觀，也可通過磁定量分析儀快速定量，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金方法有所提高。郭會燦[31]采用QD ICA技術(shù)快速檢測4種硝基呋喃類代謝物，對3-氨基-2-惡唑烷酮、1-氨基-2-乙內(nèi)酰、氨基脲和5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮的檢測限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L，交叉反應(yīng)率在0.1%以下，能夠滿足常規(guī)檢測的要求。獸藥殘留一般采用競爭性ICA檢測，T線變淺或消失意味著樣品呈陽性。相比于消色，顯色無疑是一種更靈敏的方式，Sheng W等[32]以ZnCdSe/ZnS QDs作為熒光標(biāo)記，金納米粒子作為淬滅劑，建立了一種檢測四環(huán)素類抗生素的ICA方法，在紫外燈照射下，T線的熒光強度與待測物含量成正比，該方法對于牛奶和動物肌肉組織中四環(huán)素類抗生素的檢測限分別是20 μg/L和40 μg/kg。

3.2 食品安全檢測

玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒毒B1(AFB1)等霉菌毒素一般存在于霉變的農(nóng)作物中，動物源性食品中也常有檢出，采用ICA技術(shù)可以靈敏、快速的檢出食品中的霉菌毒素和其他有害物質(zhì)。何方洋等[33]建立了檢測谷物中ZEN的膠體金ICA法，方法的檢測限為100 μg/kg，靈敏度為99%，特異性為94%。Yao X L等[34]以MNP作為信號標(biāo)簽建立了一種用于檢測食品中17 β-雌二醇(17 β-estradiol,E2)的新型ICA方法，對于牛奶、對蝦、魚類和雞肉中17 β-雌二醇的最低檢測限是0.4 ng/mL。沙志聰?shù)萚7]采用QD標(biāo)記的ICA檢測谷物中的赭曲霉毒素A，該方法的特異性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，檢測限為0.5 μg/L。激素類藥物有利于動物的生長和繁育，但食品中激素殘留超標(biāo)可能導(dǎo)致人體的激素代謝紊亂或引起其他疾病。Yao X L等[34]以游離的抗17 β-雌二醇單克隆抗體作為檢測抗體，MNP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為間接信號探針，建立了一種用于檢測食品中E2的新型ICA方法，對牛奶、對蝦、魚類和雞肉中E2的最低檢測限是0.4 ng/mL，靈敏度是常規(guī)競爭性ICA方法的5倍。

3.3 動物疾病診斷

病原微生物入侵動物機體后能夠刺激機體產(chǎn)生抗體，利用該原理可以對抗原進行檢測，診斷動物疾病。肖妍等[35]建立了一種檢測奶樣中布魯氏菌抗體的免疫層析方法，敏感性98.0%，特異性96.0%，與其他常見病原無交叉反應(yīng)，適用于大批量樣本的篩選檢測和奶牛場布魯氏菌病的快速診斷。Bian H等[36]建立了一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的膠體金ICA方法，檢測限為0.47 μg/mL(5.9×103TCID50/mL)，與其他豬病病毒無交叉反應(yīng)。

4 小結(jié)

ICA檢測過程簡便、快速，在獸藥殘留、食品安全、環(huán)境監(jiān)測以及動物疾病診斷等領(lǐng)域表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。高靈敏度、定量和高通量檢測是ICA方法的發(fā)展趨勢。熒光材料、MNPs和脂質(zhì)體等開始代替膠體金，新型材料的使用對于靈敏度的提高有積極作用。ICA結(jié)果的評價方式也隨著檢測需求而變化，既可以通過肉眼觀察直接定性，也可以使用熒光定量儀、磁閱讀器或相關(guān)軟件準(zhǔn)確定量。隨著新型標(biāo)記材料的發(fā)展和定量分析儀器的應(yīng)用，ICA技術(shù)也會得到巨大的提升，在POCT方面發(fā)揮更重要的作用。