杜小燕 霍學(xué)云 陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)是通過(guò)科學(xué)的方法對(duì)近交系動(dòng)物進(jìn)行遺傳本底的一致性檢驗(yàn)和封閉群動(dòng)物的群體遺傳學(xué)分析，評(píng)價(jià)其是否符合品系或群體特征，確保品種、品系動(dòng)物固有的遺傳組成和生物學(xué)特性。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)和方法也不斷進(jìn)步，從最初的形態(tài)學(xué)、染色體技術(shù)、蛋白質(zhì)分子和免疫學(xué)技術(shù)到分子生物學(xué)的基因檢測(cè)，經(jīng)歷了由粗放到精細(xì)、由定性到定量、由繁瑣到簡(jiǎn)便的發(fā)展歷程。上述發(fā)展，不僅顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性和可靠性，減少工作量和縮短檢測(cè)周期，而且通過(guò)遺傳檢測(cè)技術(shù)的提升，確保了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量的可靠性，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類、品種和品系維系、資源的保存、開(kāi)發(fā)和利用及動(dòng)物的選種和選育發(fā)揮重要作用。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)是借助能反映該動(dòng)物或群體遺傳本質(zhì)和特征的遺傳標(biāo)記(genetic marker)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量。遺傳標(biāo)記是生物體中基因型遺傳信息易于識(shí)別的表現(xiàn)形式，包括可用于遺傳分析的基因或序列，也包括由遺傳控制的任何表型差異，因此具有可遺傳學(xué)和可識(shí)別性兩個(gè)特征。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)形態(tài)學(xué)方法

形態(tài)學(xué)標(biāo)記(morphological markers)是以可辨認(rèn)的外觀特征為依據(jù)。我國(guó)春秋時(shí)期伯樂(lè)相馬和奧地利學(xué)者孟德?tīng)柕耐愣闺s交實(shí)驗(yàn)均為形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記的先例。用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)最常見(jiàn)的一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記是毛色，如白色或野生色分別代表不同基因型，利用毛色表型分離可以推斷近交系的毛色基因的方法稱毛色基因測(cè)試法。另一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記是頜骨(mandible)形態(tài)測(cè)定，該性狀與遺傳因素密切相關(guān)，被認(rèn)為是比較穩(wěn)定的數(shù)量性狀，例如陳哲等[1]報(bào)道對(duì)小鼠進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以在一定的坐標(biāo)圖上測(cè)量其下頜骨11個(gè)位點(diǎn)的分布，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。毛色在培育動(dòng)物的過(guò)程中是天然的遺傳標(biāo)記，故而仍在使用；頜骨標(biāo)記則在新的種系鑒定中非常有價(jià)值。然而，可用做遺傳監(jiān)測(cè)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記是有限的，而且有些又易受環(huán)境的影響。另外，下頜骨標(biāo)記需要處死動(dòng)物和比較繁瑣的操作，所以這類遺傳標(biāo)記有一定的局限性。

1.2 細(xì)胞遺傳學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)

細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記是指生物的染色體特征，以起源于20世紀(jì)50年代的染色體顯帶技術(shù)為依托[2]。常見(jiàn)的顯帶技術(shù)有Q-帶、G-帶、C-帶、R-帶、F-帶、Cd-帶、N-帶、F-帶、G-H等。其中G-帶在整個(gè)分裂間期和分裂期相對(duì)穩(wěn)定，可以用來(lái)進(jìn)行品系鑒定和遺傳監(jiān)測(cè)。1978年，Hsu等[3]用6種小鼠染色體帶紋分析其親緣關(guān)系。其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如雞、牛、長(zhǎng)爪沙鼠等均有進(jìn)行染色體核型分析的報(bào)道。除了顯帶技術(shù)，熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)也可以應(yīng)用于遺傳分析，在鑒定基因修飾動(dòng)物中應(yīng)用廣泛。

1.3 免疫學(xué)標(biāo)記監(jiān)測(cè)技術(shù)

免疫標(biāo)記(immunogenetic markers)監(jiān)測(cè)技術(shù)是指利用動(dòng)物細(xì)胞免疫成分進(jìn)行遺傳檢測(cè)，主要包括組織相容性抗原(H-2)[4]等。1958年，Snell等[5]發(fā)現(xiàn)不同基因型的小鼠之間進(jìn)行皮膚移植無(wú)法成功，由此鑒定出一系列小鼠組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)基因，并做了大量的工作。Callahan等[6]報(bào)道大鼠的種間MHC基因也存在多樣性，可進(jìn)行種的區(qū)分。對(duì)于近交系小鼠，鑒定MHC基因應(yīng)用最多的方法是皮膚移植[7]；對(duì)于單倍型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞和鴨可以采用PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行MHC基因型的檢測(cè)，并已納入2021年最新發(fā)布的北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物地方標(biāo)準(zhǔn)[8]。皮膚移植方法在新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系品系鑒定中仍然非常重要，但是該方法使用動(dòng)物數(shù)量多，觀察時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)手術(shù)操作的技術(shù)要求較高，因此在日常遺傳監(jiān)測(cè)中應(yīng)用較少。

1.4 生物化學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)

生化標(biāo)記(biochemical markers)分析方法是蛋白水平的檢測(cè)，可用于近交系的品系鑒定和封閉群群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，具有檢測(cè)基因位點(diǎn)明確、方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。我們國(guó)家在邢瑞昌等[9]科學(xué)家的努力下，研究開(kāi)發(fā)大小鼠生化位點(diǎn)方法。在1994、2004及2010版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[10]中推薦實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠16個(gè)生化位點(diǎn)和大鼠11個(gè)生化位點(diǎn)的檢測(cè)方法。除此之外，還有用于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)的報(bào)道，包括實(shí)驗(yàn)兔[11]、長(zhǎng)爪沙鼠[12]等多種動(dòng)物。生化標(biāo)記方法在品系鑒定尤其是大小鼠的鑒定中發(fā)揮著非常重要的作用。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)大小鼠常用品系位點(diǎn)的電泳位置都有準(zhǔn)確定義，但是生化位點(diǎn)的多態(tài)性較低，用于封閉群群體遺傳結(jié)構(gòu)分析時(shí)計(jì)算的雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)值均偏低。另外，生化位點(diǎn)方法對(duì)技術(shù)的要求較高，其操作和結(jié)果判斷需要具有非常豐富的經(jīng)驗(yàn)。

1.5 分子生物學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)

遺傳差異歸根結(jié)底是基因組DNA的不同，因此檢測(cè)DNA是最直接可靠的遺傳評(píng)價(jià)。DNA水平的分子遺傳標(biāo)記克服了上述方法的諸多不足，具有結(jié)果易判讀、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、檢測(cè)周期短、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，并可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)采樣，因而受到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技工作者的青睞。

1.5.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是第一代DNA水平的分子遺傳標(biāo)記。1980年Wyman等[13]發(fā)現(xiàn)了對(duì)人基因組DNA酶切可獲得RFLP，且符合孟德?tīng)栠z傳。后來(lái)Hayashi等[14]發(fā)現(xiàn)大鼠線粒體DNA中也存在RFLP。從此以后，RFLP廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物遺傳學(xué)研究，在種間鑒別中非常有價(jià)值，目前仍然廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳研究和種的鑒別，如Kovalchuk等[15]報(bào)道的用于牛β血紅蛋白A/B兩個(gè)變異體的鑒定等。RPLF操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于判斷，但在小鼠近交系間多態(tài)性較低，不宜用于小鼠近交品系的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

1.5.2微衛(wèi)星(microsatellite，MS)DNA是基因組中重要的一種重復(fù)序列，又稱短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat，STR)，由1～6個(gè)核苷酸的重復(fù)單元組成，幾乎存在于所有的有機(jī)體和細(xì)胞中。STR呈現(xiàn)孟德?tīng)柺焦诧@性遺傳，其多態(tài)性非常豐富，如封閉群小型豬的等位基因數(shù)能達(dá)到幾十個(gè)[16]。STR有一定的物種保守性，在種系間也可能有同源性，通過(guò)同源擴(kuò)增(cross amplification)可能篩選到新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物STR基因位點(diǎn)。趙太云等[17]和Du等[18]先后用大鼠或小鼠的微衛(wèi)星DNA引物成功篩選出了長(zhǎng)爪沙鼠的STR基因位點(diǎn)；Liu等[19]用長(zhǎng)爪沙鼠的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)獲得了灰倉(cāng)鼠的11個(gè)STR基因位點(diǎn)。作為分子遺傳標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA廣泛地應(yīng)用于物種鑒定、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定等很多領(lǐng)域。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)方面，微衛(wèi)星DNA也發(fā)揮著重要作用。國(guó)內(nèi)最初由陳振文教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)歐陽(yáng)兆和等[20]和李瑞生等[21]優(yōu)化PCR條件，篩選優(yōu)化小鼠和大鼠微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)并進(jìn)行應(yīng)用，之后謝建云等[22]和王洪等[23]報(bào)道用微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)對(duì)近交系和封閉群小鼠及來(lái)源于不同生產(chǎn)單位的BALB/c和C57BL/6J進(jìn)行了分析。目前已建立微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還包括豚鼠[24]、裸鼴鼠[25]、比格犬[26]等，最近Zhang等[27]建立了實(shí)驗(yàn)用雞、鴨和鵝的微衛(wèi)星DNA遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法。2021年發(fā)布的北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)小型豬、實(shí)驗(yàn)狨猴、實(shí)驗(yàn)貓、實(shí)驗(yàn)雪貂等11種(品系)動(dòng)物均推薦了微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記的檢測(cè)方法[8]。微衛(wèi)星DNA方法簡(jiǎn)單易行，比較經(jīng)濟(jì)，且結(jié)果易于判斷(可借助多種軟件)，因而受到眾多實(shí)驗(yàn)工作者的認(rèn)可。

1.5.3單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是20世紀(jì)90年代由美國(guó)學(xué)者Lander提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記[28]，突變率為10-9，與微衛(wèi)星DNA(10-2～10-4)相比遺傳穩(wěn)定性更高。常用的SNP分析方法包括直接測(cè)序法、基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析法等。大小鼠目前已建立較成熟的SNP遺傳檢測(cè)方法，岳秉飛研究團(tuán)隊(duì)建立了基于PCR擴(kuò)增的SNP大小鼠檢測(cè)方法[29-30]，杜小燕團(tuán)隊(duì)用比較多的SNP位點(diǎn)(94個(gè))分別對(duì)封閉群和近交系小鼠進(jìn)行了遺傳檢測(cè)，并比較了近交系品系間的差異和STR、SNP和生化位點(diǎn)檢測(cè)封閉群小鼠的差異[31-32]。2004年P(guān)etkov等[33]報(bào)道的Jackson實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家研究了小鼠SNP，從235個(gè)SNP凝煉出28個(gè)SNP位點(diǎn)，能夠?qū)?00多種小鼠品系進(jìn)行區(qū)分[33]。2015年Kazuyuki等[34]從1 361個(gè)SNP中開(kāi)發(fā)了100個(gè)C57BL/6N特異性位點(diǎn)，成功區(qū)分該品系的11個(gè)衍生品系(即不同生產(chǎn)商的動(dòng)物)，也可以區(qū)分C57BL/6J及其衍生品系。SNP分布廣泛數(shù)量龐大，而且適于建立高通量方法，但恰恰由于其數(shù)量太多，如何在“浩瀚大?！敝姓业阶钸m合SNP進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)，是很大的挑戰(zhàn)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的思考和展望

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和繁殖過(guò)程中一直伴隨著遺傳質(zhì)量問(wèn)題，近交系的長(zhǎng)期近親繁殖、同一品系在不同國(guó)家、地域或生產(chǎn)單位的長(zhǎng)時(shí)間隔離繁殖、封閉群動(dòng)物群體數(shù)量過(guò)小等均會(huì)引起遺傳漂變。長(zhǎng)期的人工飼養(yǎng)環(huán)境和選擇壓力會(huì)引起不可避免的突變，也包括自然突變等。目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)越來(lái)越傾向于DNA水平的技術(shù)方法，應(yīng)用這些方法時(shí)需考慮以下問(wèn)題。

2.1 遺傳檢測(cè)方法的選擇

選擇適當(dāng)?shù)倪z傳檢測(cè)方法需要綜合考慮技術(shù)人員力量、儀器設(shè)備條件、經(jīng)費(fèi)預(yù)算、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和動(dòng)物使用量所涉及的倫理要求，并結(jié)合所使用方法的特點(diǎn)、準(zhǔn)確性、重復(fù)性等多個(gè)方面，例如選用毛色標(biāo)記需要技術(shù)人員有較好的遺傳繁育知識(shí)、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高；選用STR、RFLP、SNP等分子標(biāo)記，不需要處死動(dòng)物，更符合倫理要求，快速簡(jiǎn)便，但需要掌握PCR和基因分型技術(shù)，配備毛細(xì)管凝膠電泳和熒光PCR儀；選用生化位點(diǎn)方法則對(duì)提取蛋白、蛋白電泳、染色等技術(shù)的要求較高，但獲得的多態(tài)信息含量較低，并且需要處死動(dòng)物；在近交系品系鑒定時(shí)利用皮膚移植是很準(zhǔn)確的方法，但其耗時(shí)長(zhǎng)且動(dòng)物用量較大?？傊?，科研工作人員應(yīng)根據(jù)自身的需求和條件選擇適當(dāng)?shù)倪z傳檢測(cè)方法。

2.2 分子遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的選擇

可供選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)分子標(biāo)記十分豐富，但是采用哪種方法以及選擇哪些位點(diǎn)還沒(méi)有統(tǒng)一，不同動(dòng)物的差別也較大。李銀銀等[31]用微衛(wèi)星DNA和SNP對(duì)封閉群小鼠進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)群體，用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記計(jì)算的群體遺傳參數(shù)遠(yuǎn)大于SNP和生化位點(diǎn)，其中生化位點(diǎn)由于其多態(tài)性信息含量較低，所計(jì)算的遺傳參數(shù)最小。另外，在比格犬遺傳檢測(cè)方法的研究中發(fā)現(xiàn)，有些微衛(wèi)星位點(diǎn)具有群體間的普遍性(general)，有些具有群體的獨(dú)特性(unique)。在建立遺傳檢測(cè)方法的時(shí)候，應(yīng)該選擇“general”的位點(diǎn)還是“unique”的位點(diǎn)，是一個(gè)值得思考的問(wèn)題。

2.3 檢測(cè)結(jié)果的判斷

在2010版實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)生化位點(diǎn)檢測(cè)近交系小鼠的結(jié)果判斷有很詳細(xì)的描述，因?yàn)槊總€(gè)品系的生化位點(diǎn)特征都很清楚，但是對(duì)于STR或SNP數(shù)量龐大，定義每個(gè)品系的特征性STR或SNP位點(diǎn)并非易事。另外，對(duì)24種近交系小鼠進(jìn)行STR和SNP的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果卻有所不同，SNP位點(diǎn)呈現(xiàn)品系內(nèi)單態(tài)的比例較低，這進(jìn)一步說(shuō)明SNP的精確性或敏感性高于STR。另外，目前在多個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)中推薦了微衛(wèi)星DNA或SNP用于封閉群動(dòng)物的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，但檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，有的采用平均雜合度，有的推薦用卡方檢驗(yàn)來(lái)判斷是否為平衡群體，是否應(yīng)該將香隆指數(shù)等更多遺傳參數(shù)推薦到結(jié)果判斷中，需要進(jìn)一步研究和論證。

2.4 發(fā)現(xiàn)遺傳變異的處理方式

前已述及，遺傳變異在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)繁殖中不可避免，同一品系的動(dòng)物在各生產(chǎn)單位之間由于遺傳漂變，出現(xiàn)個(gè)別位點(diǎn)的等位基因差異也很正常，例如實(shí)驗(yàn)中，用STR檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Jackson和Taconic來(lái)源的BALB/c、C3H和DBA/2分別有2個(gè)、1個(gè)和3個(gè)位點(diǎn)的等位基因型不同(未發(fā)表數(shù)據(jù))。2015年，根據(jù)Kazuyuki等[35]報(bào)道，用100個(gè)SNP的檢測(cè)結(jié)果也說(shuō)明，來(lái)自不同公司的C57BL/6 N和C57BL/6J的SNP等位基因不同[34]，說(shuō)明同一品系不同生產(chǎn)廠家的動(dòng)物是存在一定差異的。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展為遺傳質(zhì)量控制提供了新的手段，并促使我們思考以下問(wèn)題：①快速、無(wú)損傷、高通量且準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)新技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。例如，用多重PCR進(jìn)行微衛(wèi)星DNA的基因型分析，開(kāi)發(fā)和研制小鼠等常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的SNP芯片等，都將是努力的方向；②將鑒別品系轉(zhuǎn)變?yōu)殍b定品系。目前研究開(kāi)發(fā)的STR或SNP都能實(shí)現(xiàn)越來(lái)越精確的品系鑒別，無(wú)論是用4個(gè)STR位點(diǎn)還是11或100個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有效區(qū)分不同小鼠近交系或不同生產(chǎn)商家的同一品系。但是，如何對(duì)每一種(品系)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立自身特有的位點(diǎn)體系，從而對(duì)其進(jìn)行鑒定，需要全世界相關(guān)領(lǐng)域的專家長(zhǎng)期不斷協(xié)作努力，期待這一天早日到來(lái)。