黃秋月， 李中瀚， 殷旖珂

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064)

1 引 言

細(xì)胞的譜系分化與命運(yùn)決定一直是細(xì)胞生物學(xué)研究的重點(diǎn)方向.體細(xì)胞重編程與功能細(xì)胞間轉(zhuǎn)分化研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過(guò)特異性地表達(dá)少數(shù)幾個(gè)特征性的轉(zhuǎn)錄因子而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)的相互轉(zhuǎn)化，例如Oct4、Sox2、Nanog和Lin28可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC，induced pluripotent stem cells)[1]；Ascl1、Brn2、Myt1l的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)換[2]；而 Hnf4α、Foxa1/2以及Gata4、Mef2c、Tbx5組合則可以分別將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝實(shí)質(zhì)樣細(xì)胞和心肌細(xì)胞[3-4].這些研究表明，通過(guò)激活特征轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)與功能的人工改造與轉(zhuǎn)變.

傳統(tǒng)的基因過(guò)表達(dá)策略通常依賴質(zhì)粒、慢病毒、人工mRNA等形式將含有強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因引入靶標(biāo)細(xì)胞中，但是此類方法的缺陷在于當(dāng)需要引入多個(gè)基因時(shí)，投遞效率較低、載體能承受的基因大小受限以及外源基因整合可能破壞細(xì)胞內(nèi)源基因及其調(diào)控元件等，因此，開(kāi)發(fā)高效率的內(nèi)源基因激活技術(shù)逐漸成為當(dāng)前重編程與轉(zhuǎn)分化研究中的重點(diǎn)方向之一.隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，利用核酸酶活性突變體dCas9及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)建靶向內(nèi)源基因的基因激活技術(shù)已見(jiàn)報(bào)道，并被成功用于重編程與轉(zhuǎn)分化研究中，例如，可將MEF細(xì)胞重編程為iPSC[5]、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為骨骼肌細(xì)胞[6]、將iPSC定向分化為神經(jīng)元等[7].然而，dCas9介導(dǎo)的多基因激活須將多個(gè)sgRNA轉(zhuǎn)錄元件串聯(lián)，且每個(gè)元件皆須具備U6啟動(dòng)子、終止子等序列，造成質(zhì)粒構(gòu)建繁瑣且載體能承載的sgRNA元件數(shù)量有限.而近年來(lái)興起的CRISPR/Cpf1多基因編輯因其具有RNA酶活性，能夠?qū)崿F(xiàn)pre-crRNA中多個(gè)crRNA的剪切和釋放[8-9]，成為更具潛力和普適性的多基因激活工具.

Cpf1蛋白晶體采用識(shí)別葉 (Recognition lobe，REC) 和核酸酶葉 (Nuclease lobe，NUC)的二裂片結(jié)構(gòu)，呈蟹鉗狀[10].根據(jù)Cpf1識(shí)別功能域和內(nèi)切酶功能域分開(kāi)的特點(diǎn)，將NUC進(jìn)行定點(diǎn)突變使其失去核酸內(nèi)切酶活力，并與轉(zhuǎn)錄激活域融合構(gòu)建出基因激活工具.為了更能夠了解生命活動(dòng)的情況，研究各生命機(jī)體生化反應(yīng)下的多基因調(diào)控機(jī)制，本論文擬構(gòu)建以CRISPR/Cpf1系統(tǒng)為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)性基因激活系統(tǒng).

基于此，本論文采用了在C端融合三元轉(zhuǎn)錄激活域VPR(VP64-P65-Rta)的dAsCpf1、dFnCpf1、dLbCpf1，篩選獲得了最強(qiáng)激活效果的dAsCpf1-VPR系統(tǒng).此外，在該系統(tǒng)中還引入了不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(DD-domain)和四環(huán)素控制的操縱子，從蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平分別控制融合蛋白表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了特定時(shí)間、定向激活基因轉(zhuǎn)錄.最后，本論文實(shí)現(xiàn)了MYOD1、Oct4兩個(gè)基因同時(shí)激活，證明了TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)具有誘導(dǎo)性多基因激活的能力.

綜上所述，在本論文中，我們成功建立了基于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的可誘導(dǎo)性的多基因激活體系，能夠快捷、高效的通過(guò)靶向DNA進(jìn)行誘導(dǎo)內(nèi)源性激活，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行有效調(diào)控，從而具備定向調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)的效果，為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)與功能的人工改造與轉(zhuǎn)變奠定技術(shù)基礎(chǔ).

2 材料和方法

2.1 材料和試劑

人類胚胎腎細(xì)胞系HEK 293FT，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3，DMEM basic培養(yǎng)基(Gibco，C11995500BT)，胎牛血清(Natocor，NTC-HK009)，抗生素-抗真菌劑(Gibco，15240-062)，轉(zhuǎn)染試劑Doge Fect (內(nèi)蒙古尼迪生物，23427-01)，SuperScriptTMⅡReverse Transcriptase試劑盒(Invitrogen，638315)，細(xì)胞裂解液M-PER(Thermo scientific，QJ222436)，GAPDH抗體(華安，R1208-3)，HA抗體(Sigma，F(xiàn)1804-50 μg)，Anti-rabbit二抗(Invitrogen，SA5-10044)，Anti-mouse二抗(Invitrogen，SA5-10172)，polybrene(Millipore，638313).

2.2 方 法

2.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 6孔板中每孔鋪7.5×105個(gè)細(xì)胞，24 h后，在顯微鏡下檢查細(xì)胞覆蓋率，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染時(shí)，取6 μL Dogo加入94 μL DMEM中渦旋混勻后，瞬離并靜置5 min；同時(shí)1 μg目的質(zhì)粒用DMEM補(bǔ)齊體積至100 μL；瞬離后加入靜止5 min后的Dogo混合液渦旋混勻，室溫靜置30 min；最后將脂質(zhì)體與質(zhì)?；旌弦壕徛稳爰?xì)胞孔板中，輕搖混勻后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

2.2.2 免疫印跡 去除培養(yǎng)基后，加入預(yù)冷的PBS，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞置于1.5 mL的EP管中，3000 r/min離心5 min，去上清，加入適量細(xì)胞裂解液M-PER (Thermo scientific)，用移液器吹打均勻(冰上操作).每10 min震蕩一次，重復(fù)3次，隨后于4 ℃，14 000 g離心20 min，收集上清，加入4×蛋白上樣液，95 ℃孵育5 min使蛋白變性.SDS-PAGE電泳分離蛋白，23 V恒壓半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜30 min.用溶于TBST的5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(Anti-GAPDH 1∶2 000，Anti-HA 1∶1 000)于4 ℃冰箱中低溫孵育過(guò)夜，二抗(Anti-rabbit 1∶10 000，Anti-mouse 1∶10 000)常溫孵育1 h，顯影.

2.2.3 熒光定量 去除培養(yǎng)基后，加入1×PBS清洗2～3次，Trizol法提取目的細(xì)胞的總RNA，使用Invitrogen SuperScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.使用BIO-RAD SYBR Green Supermix試劑盒進(jìn)行熒光定量分析，其中Gapdh為內(nèi)參.

qPCR引物：

mus-Gapdh-F： GCACAGTCAAGGCCGAGAAT

mus-Gapdh-R：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA

mus-Myod1-F：AGCGACACAGAACAGGGAAC

mus-Myod1-R：TCGAAAGGACAGTTGGGAAG

mus-Oct4-F：GCCCTCCCTACAGCAGATCACTCACATCG

mus-Oct4-R：AAGGTGTCCCTGTAGCCTCATACTCTTCTCGT

2.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建

a) dAs/Fn/LbCpf1-VPR的構(gòu)建

使用KOD-Plus Mutagenesis Kit(公司)點(diǎn)突變?cè)噭┖蟹謩e將pcDNA3.1-As/Fn/LbCpf1-3×HA的908位、832位、917位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?；在青蘭基因合成VPR序列，通過(guò)infusion的方法將VPR連接在dCpf1的C端，構(gòu)建成pcDNA3.1-dAs/Fn/LbCpf1-3×HA-VPR ；

b) TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR的構(gòu)建

將pLVX-TRE3G空載酶切，將DD Domain片段PCR并純化，并將dAsCpf1-3×HA-VPR片段PCR并純化后，用infusion的方法將DD Domian連接于dAsCpf1-3×HA-VPR的N端，構(gòu)建成pLVX-TRE3G-DD-dAsCpf1-3×HA-VPR；

3 結(jié)果分析

3.1 構(gòu)建CRISPR/Cpf1-VPR基因激活系統(tǒng)

將來(lái)源于Acidaminococcussp.的AsCpf1的第908位，F(xiàn)rancisellanovicida的FnCpf1的第917位和Lachnospiraceaebacterium的LbCpf1的第832位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，并且在dAs/Fn/LbCpf1的C端連接了由VP64，P65和Rta(VPR)蛋白組成的三元復(fù)合轉(zhuǎn)錄激活因子的激活效應(yīng)區(qū)域(TAD)，形成具有激活作用的融合蛋白(圖1a).將需激活的靶標(biāo)基因的sgRNA設(shè)計(jì)在該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription Start Site，TSS)之前，dCpf1-VPR在sgRNA的介導(dǎo)下能夠特異性識(shí)別并且結(jié)合在該基因啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子區(qū)域，VPR通過(guò)招募細(xì)胞因子或其他共轉(zhuǎn)錄激活因子，并結(jié)合形成多元復(fù)合物，進(jìn)而定向激活靶標(biāo)基因(圖1b).

圖1 dCpf1-VPR激活系統(tǒng)的構(gòu)建策略

3.2 dCpf1-VPR激活系統(tǒng)能夠定向上調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄

圖2為NIH3T3細(xì)胞中Oct4基因的轉(zhuǎn)錄水平.結(jié)果顯示，dAs/Fn/LbCpf1-VPR三種激活系統(tǒng)都有不同程度的激活作用，其中在dAsCpf1-VPR系統(tǒng)下的Oct4基因mRNA水平與對(duì)照組相比可提升到104倍，證明dAsCpf1-VPR系統(tǒng)激活效果最強(qiáng).因此我們將選用dAsCpf1-VPR激活系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn). 同時(shí)測(cè)試由單個(gè)sgRNA介導(dǎo)下的激活效果，sgRNA-2和5介導(dǎo)的激活效果與對(duì)照組相比提升到102倍，并且證明了由sgRNA-2和5介導(dǎo)的激活效果與5個(gè)sgRNA介導(dǎo)的的強(qiáng)度相同，與對(duì)照組相比可提升到104倍.

3.3 構(gòu)建誘導(dǎo)性激活系統(tǒng)

為了構(gòu)建誘導(dǎo)性基因激活系統(tǒng)，將TET-ON系統(tǒng)和不穩(wěn)定配體(DD Domain)與dAsCpf1-VPR相結(jié)合，形成可由TMP和Dox小分子藥物誘導(dǎo)的基因激活系統(tǒng)(圖3).DD Domain是來(lái)源于大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DHFR)突變體的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，能夠在小分子化合物TMP的存在下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促使其融合蛋白DD-dAsCpf1-VPR穩(wěn)定表達(dá).TET-ON系統(tǒng)中蛋白的表達(dá)受到TRE3G啟動(dòng)子的控制.只有在Dox存在的情況下，rtTA才能促使TRE3G啟動(dòng)子發(fā)揮作用并致使下游基因的轉(zhuǎn)錄.

圖2 dCpf1-VPR系統(tǒng)定向激活Oct4基因轉(zhuǎn)錄情況

圖3 構(gòu)建誘導(dǎo)性激活系統(tǒng)

3.4 TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)蛋白穩(wěn)定表達(dá)和誘導(dǎo)性基因激活

為了驗(yàn)證TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)的誘導(dǎo)控制效果，分別從蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證.圖4a結(jié)果顯示，在Dox和TMP雙藥誘導(dǎo)下DD-dAsCpf1-VPR融合蛋白均得到高表達(dá)，且誘導(dǎo)系統(tǒng)的本底水平表達(dá)量很低.同時(shí)圖4b結(jié)果顯示，加雙藥誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，Oct4基因的mRNA水平提高了250倍，能顯著提高Oct4基因的轉(zhuǎn)錄水平.以上結(jié)果說(shuō)明，TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)可以在Dox和TMP雙藥的誘導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的誘導(dǎo)性激活.

圖4 Dox和TMP雙藥誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和基因激活情況

圖5 單個(gè)sgRNA介導(dǎo)Myod1基因的激活情況和Dox、TMP雙藥誘導(dǎo)下多基因激活的情況

3.5 TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)能夠介導(dǎo)誘導(dǎo)性多基因激活

圖5b為Myod1基因由單個(gè)sgRNA介導(dǎo)的激活效果，篩選出了激活效果較強(qiáng)的sgRNA-1和5.然后同時(shí)對(duì)Myod1、Oct4基因進(jìn)行激活，根據(jù)圖5c的結(jié)果顯示，Myod1、Oct4基因的轉(zhuǎn)錄水平分別在

Dox和TMP單藥的控制下，能夠?qū)崿F(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)錄水平的提升.在Dox誘導(dǎo)下，Myod1和Oc4基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提升了大約50倍和70倍，在同時(shí)加雙藥的條件下可分別提高80、120多倍，表明TRE-3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)可以高效介導(dǎo)誘導(dǎo)性多基因激活.

4 討 論

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，利用核酸酶活性突變體dCas9及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)建靶向內(nèi)源基因的基因激活技術(shù)已見(jiàn)報(bào)道，并被成功用于重編程與轉(zhuǎn)分化研究中.然而，dCas9介導(dǎo)的多基因激活須將多個(gè)sgRNA轉(zhuǎn)錄元件串聯(lián)，且每個(gè)元件皆須具備U6啟動(dòng)子、終止子等序列，造成質(zhì)粒構(gòu)建繁瑣且載體能承載的sgRNA元件數(shù)量有限.CRISPR/Cpf1系統(tǒng)是近年來(lái)興起的多基因編輯系統(tǒng)，其突出特點(diǎn)是，Cpf1具有RNA酶活性，能夠促使pre-crRNA中的多個(gè)crRNA的剪切和釋放，因此更具備作為多基因激活工具的潛力和普適性.

為了能夠更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)與功能的人工改造與轉(zhuǎn)變，本文構(gòu)建了基于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)下能夠定時(shí)定向激活多基因的工具.為了篩選出最高效激活能力的Cpf1，對(duì)比了dAs/Fn/LbCpf1-VPR的激活效果.基于此，為了構(gòu)建可誘導(dǎo)的Cpf1基因激活技術(shù)方法，在dAsCpf1-VPR的N端引入了不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(DD-domain)和四環(huán)素控制的操縱子,通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和蛋白穩(wěn)定性兩個(gè)層面添加誘導(dǎo)性調(diào)控元件，證明能夠在Dox和TMP雙藥調(diào)控下蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的高效誘導(dǎo)表達(dá)和激活.最后，對(duì)MYOD1、Oct4兩個(gè)基因同時(shí)激活，證明TRE3G-DD-dAsCpf1-VPR系統(tǒng)具有誘導(dǎo)性多基因激活的能力.綜上所述，成功將CRISPR/Cpf1系統(tǒng)與TET-ON系統(tǒng)融合，建立了誘導(dǎo)性多基因激活體系，能夠快捷、高效的通過(guò)靶向DNA進(jìn)行誘導(dǎo)內(nèi)源性激活，在DNA水平上對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行有效調(diào)控，具有定向調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)與功能的人工改造與轉(zhuǎn)變的潛力.