李雪丹， 徐 緋， 王 璨,3， 徐 恒

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川省環(huán)境保護土壤生態(tài)保護與污染防治重點實驗室， 成都610064;2.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 安陽455000;3.西南交通大學(xué)， 成都610064)

1 引 言

2010年12月12日，清華大學(xué)和二灘水電開發(fā)有限責(zé)任公司共同建設(shè)的中國首個極深地下實驗室——“中國錦屏地下實驗室”(CJPL)投入使用. 該地下實驗室位于四川雅礱江錦屏水電站，實驗室上層山體巖石厚度達2 400多米[1]. 錦屏地下實驗室的宇宙線通量相當(dāng)于地面宇宙線通量的億分之一甚至更小. CJPL是目前世界上巖石覆蓋最深的地下實驗室，是世界上最好的超低本底實驗室. 巖層極端微生物是CJPL自然區(qū)域的重要組成部分，研究巖層極端微生物資源，探索這些極端微生物的生命代謝對探索人類起源、尋找外太空生命具有重要意義.

極端微生物指在一般生物無法生存的極端環(huán)境中能夠生存的微生物. 極端微生物由于其特有的遺傳物質(zhì)、生理生化響應(yīng)和代謝途徑對生命科學(xué)的研究具有重大意義. Dylan Chivian等在南非地下金礦2.8 km發(fā)現(xiàn)一種新物種細菌，因其生存環(huán)境類似土星六號衛(wèi)星，所以命名此細菌為“大膽旅行者(The bold traveller)”，不同于其他生物體，具有生活在完全隔離環(huán)境中的能力，該菌生活環(huán)境處于極端狀態(tài)：60 ℃、黑暗無光、無氧、無有機物、單一物種、與世隔絕；研究推測出該菌完整的代謝途徑：能量源來自周圍巖石鈾的衰變，碳源來自 CO2及周圍巖石 CO32-，氮源來自H+與巖石反應(yīng)形成的 NH3，磷源來自巖石磷酸鹽氧化還原形成的PO43-，該研究結(jié)果已發(fā)表在《Science》上[2]. 2014年K?nneke等研究表明氨氧化古菌(泉古菌門和奇古菌門)通過改變羥基丙酸/羥基丁酸循環(huán)，使其代謝過程發(fā)生變化，促使該途徑的能源效率遠高于其他自養(yǎng)途徑，促使氨氧化古菌能夠在低營養(yǎng)環(huán)境下茁壯成長[3]. 2015年日本學(xué)者在《Science》報導(dǎo)：在海底1.5～2.5 km，溫度40～60 ℃的地層中發(fā)現(xiàn)細菌并成功培養(yǎng)，每立方厘米沉積物中菌細胞數(shù)約10～10 000個，其中煤層處最豐富，分析顯示這些微生物類似森林土壤細菌(包括產(chǎn)甲烷菌)，推測千萬年前因地質(zhì)構(gòu)造隨森林一同埋入海底的土壤土著菌仍存活，它們以海底埋藏的森林為能源，是天然氣形成的主要原因，此次發(fā)現(xiàn)微生物深度刷新了新記錄，成為世界最深[4]. 同年Reitschuler等研究了阿爾卑斯山一個無人類活動痕跡洞穴表面的月奶石沉積物中微生物群落進，發(fā)現(xiàn)一種能耐受低溫和營養(yǎng)匱乏的古細菌群落，優(yōu)勢菌株在親緣上與氨氧化古菌接近，其可能在黑暗洞穴中僅靠氧化環(huán)境中的氨獲得生存能量[5]. 大量研究表明，在巖石、沉淀物、高溫泉水等極端環(huán)境中存在大量極端微生物，其數(shù)量和種類超出人類想象.

傳統(tǒng)的微生物研究方法，如顯微鏡觀察微生物形態(tài)、平板計數(shù)法、微生物純種分離和生理生化反應(yīng)鑒定微生物等存在很大的局限性. 越來越多的研究表明：環(huán)境中可分離培養(yǎng)的微生物種類所占比例不到微生物種類總數(shù)的1%，其中99%以上的微生物極難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)[6-8]. 用傳統(tǒng)的微生物研究方法僅能對環(huán)境中極少數(shù)的微生物種類進行研究，不能代表環(huán)境中復(fù)雜的微生物群體. 極端環(huán)境，鹽湖(鹽度)、熱泉(高溫)、冰川及凍土(低溫)、酸性尾礦水(極酸)、堿湖(強堿)、深海(高壓、貧營養(yǎng)、缺氧、少光等)、地下深部(無光、缺氧、高壓、高溫、高鹽、高輻射、貧營養(yǎng)等)、沙漠(缺水、紫外輻射強烈、貧營養(yǎng)等)等中的微生物因生活條件苛刻、生長周期長等原因更難用傳統(tǒng)方法研究. 基于非培養(yǎng)基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法可以通過從環(huán)境樣品中直接提取微生物的DNA，快速、系統(tǒng)地對環(huán)境樣品中微生物組成、結(jié)構(gòu)和多樣性分析，較為全面、真實的反映微生物的狀態(tài). 16S rDNA序列總長度為1 540 bp，基因序列長短適中，結(jié)構(gòu)中即有保守區(qū)域又有變異區(qū)域[9]，是最常用的生物標記物，廣泛用于細菌的分類、系統(tǒng)進化和多樣性研究中.

由于“中國錦屏地下實驗室”(CJPL)位于地下2 400多米，其極深的自然條件提供了完美的“潔凈本底”. 本研究對CJPL原始極深環(huán)境中極端微生物資源進行研究，為后續(xù)研究其能量溯源提供研究基礎(chǔ). 本研究可向人類提供現(xiàn)在不完全了解的基因庫，而且在生物學(xué)理論上也有極大意義，對于推動生物科學(xué)，探索新的可開發(fā)生物資源有著重要意義.

2 材料與方法

2.1 材 料

采樣地點為2014年啟動建設(shè)的“中國錦屏地下實驗室”第IV組實驗洞8#洞，軸線方位角N58°W，距離地表2 400 m. 2016年12月共采樣11個用于分析微生物多樣性，其中4個巖石樣品(3.1 m處碎石S1，5 m處碎石S2，鉆井附近對照樣碎石S3，東北角60°方位碎石S4)，7個洞內(nèi)水樣(東北角60°方位水樣W1，泉眼處(1.2.3)水樣W2a、W2b、W2c，洞內(nèi)水池水樣W3，氣泡狀巖石滲水樣W4，洞池氣泡附近水樣W5)，見圖1. 采用巖芯鉆機采集巖石樣品后裝入無菌采樣袋，巖壁縫隙滲透水樣收集至無菌采用瓶中，立即放入液氮中保存運輸至實驗室.

圖1 樣品采集位置

2.2 方 法

2.2.1 DNA提取與純化 巖石樣品表面消毒后于無菌環(huán)境下取出巖心用于總DNA提取，將巖心用無菌水浸泡，浸泡水用0.22 μm濾膜過濾. 水樣在超凈臺用0.22 μm濾膜進行過濾，采用CTAB法進行DNA提取. 將提取的DNA置于-80 ℃保存，待測序.

2.2.2 高通量測序 提取樣品總 DNA 后，根據(jù)細菌V3+V4 區(qū)設(shè)計得到引物(F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R: 5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)，合并引物接頭，進行 PCR 擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化合成測序文庫，對建好的文庫進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后在 Illumina MiSeq 2500 平臺進行測序.

2.2.3 測序數(shù)據(jù)過濾及拼接 根據(jù) PE reads之間的 Overlap 關(guān)系，將測序所得的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列 Tags，同時對 Reads質(zhì)量和 Merge效果進行質(zhì)控過濾. 首先，使用 FLASH v1.2.7軟件，通過 Overlap 對每個樣品的 Reads 進行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags 數(shù)據(jù). 其次，使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags 進行過濾，得到高質(zhì)量的 Tags 數(shù)據(jù). 再使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù).

2.2.4 OTU(Operational Taxonomic Unit)分析利用 QIIME 軟件中的 UCLUST 對Tags在 97% 的相似度水平下進行聚類、獲得 OTU，并基于 Silva 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(Release128, http://www.arb-silva.de)對 OTU 進行分類學(xué)注釋.

2.2.5 Alpha 多樣性分析 Alpha多樣性反映的是單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，使用 Mothur 軟件，對樣品 Alpha 多樣性指數(shù)進行評估. 用計算群落豐度的Chao1 和 Ace 指數(shù)和計算群落多樣性的 Shannon 和 Simpson 指數(shù)作為Alpha 多樣性的衡量指標[10].

2.2.6 Beta 多樣性分析 Beta多樣性用來比較不同樣品在物種多樣性方面存在的差異大小. 基于Binary accard、Bray curtis、(Un)weighted unifrac (限細菌)多種算法呈現(xiàn)物種多樣性矩陣[11]. 基于 R 語言平臺繪制樣本主成分分析(PCA)、主坐標分析(PCoA)以及環(huán)境因子與樣本組成相關(guān)性分析(RDA/CCA).

3 結(jié) 果

3.1 基因組DNA提取與測序數(shù)據(jù)分析

樣品宏基因組提取后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，NanoDrop檢測DNA純度和濃度. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示樣品均有目標條帶出現(xiàn)，DNA完整性較好. NanoDrop結(jié)果顯示樣品濃度和純度符合送樣測序要求. 對樣品DNA進行建庫并在Illumina MiSeq 2500 平臺進行測序，結(jié)果如表1所示：11個樣品測序共獲得 879 756 對 Reads，雙端 Reads 拼接、過濾后共產(chǎn)生732 477 條 Clean tags，平均每個樣品產(chǎn)生79 978條 Clean tags；樣品的測序質(zhì)量均較高， Q20值在大于96%，Q30值在94%以上；所有樣品中細菌的GC含量均高于50%，S1細菌的GC含量最高(56.83%). Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量足夠大，增加數(shù)據(jù)量并不會增加OTU，見圖2. 基于97%相似性聚類獲得OTU數(shù)1 318個(不同樣品間取并集)，其中S1樣品中OTU最多，W2a、W2b和W2c樣品中的OTU最少，見圖3. 巖石樣品與水樣中共有OTU(共有微生物)數(shù)為873個，巖石中特有的OTU數(shù)為321個，水樣中特有的OTU數(shù)124個，見圖4.

表1 樣品測序結(jié)果和拼接的Tags數(shù)

圖2 樣品Shannon index曲線

圖3 樣品OTU個數(shù)分布圖

3.2 多樣性分析

在 97% 相似度水平下，對樣品 Alpha 多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計(表2). Chao1 和 Ace 指數(shù)簡單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況. Shannon 和 Simpson 指數(shù)受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性. 由表2可以看出S1樣品的Alpha多樣性最高，其次為S3和W4，W2b和W2c樣品的單個樣品內(nèi)部的物種多樣性較低.

圖4 不同樣品間特異性細菌OTU數(shù)量

基于 UniFrac 的加權(quán)和非加權(quán)的主坐標分析其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為41.88%、15.99%和35.92%、23.94%. 采用非加權(quán)組平均法進行聚類分析，分析結(jié)果表明S4和W1樣品間間物種組成的相似性較高；W4和W5樣品間間物種組成的相似性較高；W2b和W2a品間間物種組成的相似性較高，圖5.

表2 樣品Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

圖5 樣品UPGMA聚類樹

3.3 物種注釋及分類學(xué)分析

本研究對各樣本進行了物種注釋，詳細的分類和整理了各個樣品具體的菌群結(jié)構(gòu).各個樣品在門和屬水平上物種組成結(jié)構(gòu)存在一定差異，見圖6.

各樣品細菌物種注釋到24個門，11個樣品中絕大數(shù)微生物屬于變形菌門(Proteobacteria)，除樣品S4中有0.15%的微生物被鑒定為Unknown，其他樣品中只有極小一部分微生物被鑒定為Unknown.擬桿菌門(Bacteroidetes)在各個樣品中的相對豐度均大于1%，此外放線菌門(Actinobacteria)(W2b 0.86%)和厚壁菌門(Firmicutes)(S3 0.36%)在各個樣品中的相對豐度均大于1%. 酸桿菌門(Acidobacteria)在巖石樣品中的含量大于1%(除S2 0.43%)，而在水樣中均小于1% (W1 1.26%).

圖6 不同樣品細菌在(A)門和(B)屬水平的相對豐度

在屬水平上，共獲得345個屬. 在11個樣品中含量均較高的是桿菌屬(Bacterium)，其次在巖石樣品中相對含量較多的是假單胞菌屬(Pseudomonas)，在水樣中含量較多的是Paucimonas. 位于前10的微生物屬還有噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、涅瓦菌屬(Nevskia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、單胞菌屬(Polaromonas)、γ-變形菌綱的Alkanindiges、Alkanibacter和Perlucidibaca.

3.4 功能預(yù)測

通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，使用基因功能預(yù)測PICRUSt軟件推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本在功能上的差異. KEGG分析顯示共獲得299個預(yù)測的KEGG，11個樣品中豐度較高的代謝通路相同，涉及的代謝通路有：碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、異源物質(zhì)的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、膜轉(zhuǎn)運、翻譯和信號傳導(dǎo)等，見圖7A. COG分析也表明11個樣品中COG功能預(yù)測是相同的，包含氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制等，見圖7B.

圖7 基因(A)KEGG和(B)COG功能預(yù)測

4 討 論

在自然環(huán)境中，99%以上的微生物不可在實驗室純化培養(yǎng)，這些不可培養(yǎng)微生物是研究環(huán)境微生物多樣性的最大障礙. 傳統(tǒng)的微生物形態(tài)觀察、生理生化測定及分離純化鑒定不僅周期長而且無法對這類不可培養(yǎng)微生物進行研究. 隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于序列分析為微生物的鑒定提供了新的思路. 16 rDNA是根據(jù)97%的序列相似性水平來劃分種屬，能尋找到新物種且操作簡便可行，相似性低于97%則可認為是一個新的物種. 16S rDNA v3+v4 區(qū)的序列差異性較大，含有豐富的信息，可根據(jù)序列信息快速的進行細菌的鑒定. 本研究采用Illumina MiSeq 2500測序技術(shù)，克服了環(huán)境中大部分細菌不可培養(yǎng)的難題，對錦屏極深巖層環(huán)境中的微生物進行了比較全面的檢測. Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線已經(jīng)進入平臺期，達到實驗需要的理想水平，更多的數(shù)據(jù)量對于發(fā)現(xiàn)新的 OTU 貢獻很小，且覆蓋率高于99%，說明此次測序數(shù)據(jù)比較全面的覆蓋了樣品中的微生物，能夠真實全面的反映其組成情況.

在門水平上，樣品中的優(yōu)勢菌群均為變形菌門. 在屬水平上，樣品S1、S3、S4、W2a、W3和W4的優(yōu)勢菌群均為桿菌屬，S2的優(yōu)勢菌群為變形菌門不動桿菌屬，W1的優(yōu)勢菌群為變形菌門Silanimonas屬，W2b的優(yōu)勢菌群為變形菌門Perlucidibaca屬，W2c的優(yōu)勢菌為變形菌門Alkanindiges屬，W5的優(yōu)勢菌群屬于變形菌門Paucimonas屬. 在屬水平進行Beta多樣性分析，S4和W1樣品間物種組成的相似性較高；W4和W5樣品間間物種組成的相似性較高；W2c、W2b和W2a品間間物種組成的相似性較高. S4與W1取樣位點一種，均在錦屏8#洞東北角60 ℃，W1為該處水樣，S4為該水樣附近巖石沉積物，W1和S4間有3個屬的微生物相對豐度差異較大：變形菌門Silanimonas屬(W1 16.2%, S4 0.34%)是存在于溫泉中的嗜熱的革蘭式陰性菌，最適生長溫度為50-55 ℃，可以分解幾丁質(zhì)獲取營養(yǎng)[12]；變形菌門涅瓦菌屬(Nevskia)(W1 1.2%, S4 9.67%)為革蘭式陰性嚴格需氧菌的化能有機營養(yǎng)型細菌，生活最適溫度為20～25℃[13]；假單胞菌屬(Pseudomonas)(W1 0.29%, S4 14.41%)需氧的革蘭氏染色陰性菌，大多菌的適溫為30 ℃. W4與W5樣品間物種組成的相似性較高是由于其取樣位點相鄰. W2c、W2b和W2a物種組成的相似性較高是由于其取樣位點相同.

在種水平上，各個樣品中桿菌(bacterium)占70%以上，本研究將裝甲菌門、擬桿菌門、綠菌門、藍細菌門、變形菌門、厚壁菌門等門中的桿菌統(tǒng)計到一起. 其次是可以在室溫0 ℃以下(水溫12℃以下)將銨態(tài)氮、NO2-轉(zhuǎn)化為NO3-硝化菌屬的Perlucidibacasp.[14]，本研究中該菌只存在于水樣中. 而噬堿屬Aquiflexumsp. 只存在于巖石樣品中，具有將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的能力[15]，此外，從印度羅娜堿性火山口湖分離純化的一株Aquiflexumsp. DL6可產(chǎn)生大量催化硝基芳香化合物為芳香胺的硝基還原酶和還原偶氮染料中偶氮鍵的NAD (P) H偶氮還原酶[16-17]. 硫氧化共生有機體細菌主要存在于W4樣品中，大約占該樣品總細菌數(shù)量的1%，在樣品S2、S3、S4、W1、W3、W5也含有該菌，但數(shù)量較少. 硫氧化共生有機體細菌為自養(yǎng)型微生物，通過氧化環(huán)境中的還原態(tài)硫化物獲得能量，能夠固定二氧化碳滿足自身和共生體的生長，研究發(fā)現(xiàn)海綿共生的硫氧化菌與其宿主發(fā)生了共進化，既能自養(yǎng)也能異養(yǎng)[18]. 從云南騰沖溫泉酸性水樣分離得到一株中度嗜熱嗜酸硫氧化桿菌MTH-04，該菌能利用硫磺、硫代硫酸鈉、四硫酸鉀作為能源生長，不能利用硫酸亞鐵、黃鐵礦、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖，在有硫磺作為能源時也不能利用這些有機質(zhì)進行混合型生長[19].

巖石樣本S1中發(fā)現(xiàn)的酸桿菌門Subgroup 6，在美國懷俄明州低凱恩洞穴(Lower Kane Cave, Wyoming, USA)、西班牙阿爾塔米拉洞窟(The subaerial non-sulfidic Altamira Cave, Spain)中也發(fā)現(xiàn)了該OTU，Subgroup 6與ε-變形菌、γ-變形菌和α-變形菌間存在功能上的相關(guān)性[20]. S1特有的放線菌門Gaiella屬是非運動的桿狀革蘭式陰性菌，在葡萄牙中部的一家礦泉水公司的150米深鉆孔中也發(fā)現(xiàn)該屬細菌[21]. S1特有的芽單胞菌門Longimicrobiaceae是一種化學(xué)有機異養(yǎng)革蘭氏陰性菌，首次發(fā)現(xiàn)于地中海森林土中，可在低營養(yǎng)條件下生存[22]. 在S4、W1、W4和W5中發(fā)現(xiàn)的變形菌門Oligoflexaceae科OTU在撒哈拉沙漠的東部邊緣的砂碎石樣品中也有發(fā)現(xiàn)，Oligoflexus細菌可在低營養(yǎng)條件下生長[23]. 在S4、W4和W5中均發(fā)現(xiàn)一個未知菌，有待進一步進行鑒定.

水樣中特有的OTU 擬桿菌門Cryomorphaceae廣泛存在于水生棲息地，如河流巖石、海水、海洋沉積物、海岸沙灘和內(nèi)陸河水體等，貫穿熱帶和極地，通常存在于有機碳富裕的地方[24]. 水樣中特有OTU 變形菌門Limnobacter屬首次分離于淡水湖沿岸沉積物中，是一類硫代硫酸鹽異養(yǎng)細菌，在日本營養(yǎng)匱乏的火山沉積中發(fā)現(xiàn)一株Limnobacter屬菌株KP1-19T可利用硫代硫酸鹽作為額外的能量來源[25-26].

W1樣品特有的變形菌門PorticoccaceaeOTU主要存在于海洋環(huán)境中，該科的某些物種可運用視紫質(zhì)將光能作為額外能源[27]. W1特有變形菌門Polynucleobacter屬OTU是一些游仆蟲屬的內(nèi)共生菌株，但也有些菌株可獨立生存于淡水、池塘和河流[28]. W2樣品中特有的變形菌門Alkanibacter屬OTU是無孢子產(chǎn)生的革蘭氏陰性菌，分離于煉油廠的Alkanibacter屬細菌可以己烷作為唯一碳源，也可以羥基丁酸和琥珀酸鹽為碳源，最適生長溫度30 ℃，溫度低于13 ℃或者高于45 ℃不生長[29]. W4特有厚壁菌門Desulfosporosinus屬OTU廣泛存在于環(huán)境中，如原始含水層、城市飲用水、水稻根部和永久凍土，該屬菌株343T含有b-細胞色素并將乳酸鹽作為電子供體還原硫酸鹽和硫代硫酸鹽[30].

本研究是世界首次對錦屏地下2 400多米“中國錦屏地下實驗室”(CJPL)8號洞的微生物多樣性進行研究，后續(xù)將對采樣處地球物理化學(xué)環(huán)境進行研究，探索微生物多樣性與地球環(huán)境間的關(guān)系，為研究極端微生物能量溯源奠定基礎(chǔ)，對于推動生物科學(xué)，探索新的可開發(fā)生物資源有著重要意義.