羅興永， 董源源， 龍 娟， 童 英

(四川大學生命科學學院生長代謝與衰老研究中心, 成都 610064 )

1 引 言

全反式維甲酸(All-trans-retinoic acid，ATRA) 屬于類維甲酸家族成員，是維生素A的活性代謝產物，在細胞增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)育中具有重要作用[1].ATRA被認為是第一個腫瘤治療的靶向藥物，在臨床上主要用于治療急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].APL是急性髓系白血病的一種獨特亞型，表達早幼粒細胞白血病-維甲酸受體α(PML-RAR-α)癌蛋白，其特征在于纖溶酶產量增加導致嚴重出血.ATRA通過抑制纖溶酶的產生和降低膜聯蛋白A2和S100A100的表達在誘導白血病細胞分化、促進細胞凋亡以及改善出血癥狀等方面發(fā)揮了重要作用[1].ATRA的臨床應用將APL從一種高度致命的癌癥轉化為一種高度可治愈的疾病[2].

由于ATRA在APL中的臨床應用取得了巨大的成功，ATRA在治療多種人類惡性腫瘤方面得到了廣泛的研究.然而，APL的遺傳和生理病理簡單性在人類腫瘤中是相當罕見的，APL因此是目前發(fā)現的唯一對ATRA作出有效反應的惡性腫瘤[2].越來越多的研究表明，ATRA可以增強其它化療藥物的抗癌效應：在體外，ATRA與順鉑聯合應用可顯著抑制肝癌細胞的生長，促進其凋亡[3].ATRA與多西他奇(docetaxel)或泰索帝(taxotere)聯合應用可促進前列腺癌和乳腺癌細胞死亡的誘導[4].有機砷化三聚氰胺(Organic arsenical melarsoprol)與ATRA聯合使用可明顯抑制人乳腺癌和前列腺癌細胞的體外和體內生長[2].ATO(arsenic trioxide)還可與ATRA協同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌細胞的生長和凋亡[2].

受細胞系以及培養(yǎng)條件的影響，不同細胞對特定藥物的耐受性不同，在ATRA的使用中發(fā)現不同細胞的ATRA有效濃度不同：類維生素A 6-OH-11-O-羥基菲汀(6-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF)是ATRA的合成衍生物[5].體外研究表明IIF可有效抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[6].40 μmol/L和80 μmol/L的IIF處理24h可顯著誘導SaOS-2細胞凋亡，但對U2OS細胞沒有明顯效應[7].用5～50 μmol/L的ATRA處理PANC-1細胞1-6 d，可呈劑量/時間依賴性抑制PANC-1細胞生長[8].1～10 μmol/L維甲酸衍生物在多種腫瘤細胞中具有顯著的抗腫瘤作用，也有文獻報道10倍低濃度(100～500nm的)ATRA可以抑制人髓母細胞(Medulloblastoma ，MB)的增殖[2].但是，一些研究發(fā)現吸煙者如果攝入維甲酸會導致肺癌發(fā)病率增高[9]，暗示維甲酸可能具有促進腫瘤發(fā)生的作用.在五種鱗狀細胞癌(squamous cell carcinom，SCC)細胞中，20 nmol/L ATRA可導致細胞數增加30%，而40～100 nmol/L ATRA則可將細胞增殖減少20～30%[10].

硼替佐米(Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341)是用于治療多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)的臨床藥物.研究表明BTZ通過可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統[11]，進而通過各種機制誘導細胞死亡，包括抑制核因子-Kβ的活性，激活p53，積累錯折疊蛋白等[11].

不同濃度的ATRA是否會對胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細胞產生不同的影響還未有研究，因此在本文中我們用濃度跨度較大的ATRA處理這兩種細胞.實驗結果表明，不同濃度的ATRA對PANC-1和U2OS細胞生長的影響不同，低濃度的ATRA促進PANC-1和U2OS細胞生長，高濃度則抑制其生長.我們還發(fā)現，BTZ可以通過凋亡途徑促進細胞死亡，ATRA的促生長或抑生長的作用都可被BTZ調控，同時低濃度ATRA與BTZ聯合應用會降低凋亡前蛋白Procaspase3的表達，表明聯合用藥可能影響細胞的凋亡途徑.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 實驗細胞株 骨肉瘤細胞U2OS和胰腺癌細胞PANC-1購買自CCTCC，保存在四川大學生命科學學院生長代謝衰老研究中心.

2.1.2 主要試劑 ATRA購于sigma公司(R2625)；BTZ購于sigma公司(S1013)；MTS購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、0.25%胰蛋白酶均購自美國hyclone公司；二甲亞砜(DMSO) 購于Sigma公司；ECL 顯影液，PVDF 膜購于Milipore 公司；蛋白分子 Marker購于Fermentas 公司；PMSF購自MERCK公司；蛋白定量試劑盒購自BIO-RAD公司；甘氨酸、SDS購自Amresco公司；APS，TEMED，pH 6.8 Tis-HCl 與pH 8.8 Tis-HCl，脫脂奶粉，10%SDS溶液，30% 丙烯酰胺ACR購于Thermo公司；相關抗體：Actin(Sungene biotech-6G3；1：6000稀釋)；Caspase3(CST-9662；1：1000稀釋)，羊抗兔IgG購自Santa Cruz Biotechnology.

2.2 方 法

2.2.1 細胞存活率的檢測 骨髓瘤細胞U2OS和胰腺癌細胞PANC-1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞生長至對數期，使用胰酶消化成單細胞懸液，使用臺盼藍染色，細胞計數板計數，96孔板中每孔加入10 000個細胞，37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育12 h，細胞密度為80%左右加入ATRA處理24 h，換液之后每孔加入10 μL的MTS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育指定時間(U2OS 2 h，PANC-1 3 h)，然后在490 nm波長下檢測吸光值.

實驗共設置3組：藥物實驗組(培養(yǎng)基+細胞+藥物)，藥物對照組(培養(yǎng)基+細胞+DMSO)和空白對照組(培養(yǎng)基)，每個組設置6個重復孔.

細胞存活率的計算：細胞存活率=(藥物實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(藥物對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)*100%

2.2.2 Western-blotting(WB) 常規(guī)方法進行Western雜交.收集細胞沉淀置于冰上，EBC裂解液裂解30 min，期間每間隔10 min漩渦震蕩儀震蕩30 s然后4 ℃15 000 g離心20 min，將上清移入新EP管并測定蛋白濃度.蛋白樣品經12%SDS-PAGE膠電泳，電轉至PVDF膜， 5%脫脂牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3×10 min，二抗室溫孵育1h，TBST漂洗3×10 min.最后經ECL顯影液，使用凝膠成像系統進行成像.

2.2.3 數據處理 采用Graphpad prism 6軟件進行統計學分析，在結果圖中以均數±標準差(mean±SD)表示，實驗獨立重復至少2次，組間設置6個重復組，以one-way ANOVA統計方法分析組間差異，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

3 實驗結果

3.1 ATRA濃度不同對細胞生長的影響不同

實驗中用不同濃度的ATRA(5、10、20、40、80、100、150、200 μmol/L)分別處理PANC-1和U2OS細胞24h，采用MTS法檢測ATRA對細胞活力的影響.結果顯示，ATRA對PANC-1細胞的生長依據濃度的不同而有不同的效果.在PANC-1細胞中，低濃度(20，40，80，100 μmol/L)的ATRA表現出顯著的促進生長的趨勢(P<0.001).相反的，高濃度(200 μmol/L)ATRA可明顯抑制PANC-1細胞的生長.有趣的是，極低濃度的ATRA(5 μmol/L)則表現出對PANC-1細胞生長的抑制作用(P<0.05)，抑制率為89.50%±0.199(圖1A，表1).在U2OS細胞中，我們也觀察到類似的現象.低濃度(10，20，40，80 μmol/L)的ATRA可促進細胞的生長，特別是20，40 μmol/L(P<0.01).隨著濃度的升高， 150，200 μmol/L的ATRA表現出對U2OS細胞生長的顯著抑制作用(P<0.001)(圖1B，表1).與PANC-1細胞不同的是，5 μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS細胞的生長，這個獨特現象暗示PANC-1細胞中可能存在與U2OS細胞不同的ATRA應答方式.

圖1 ATRA對PANC-1和U2OS細胞活力的影響

3.2 低濃度ATRA的促生長效應可被BTZ抑制

蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)是常用的一種臨床抗癌藥物，聯合應用BTZ和其它化療藥物顯示出較強的抗癌活性.為了檢測ATRA和BTZ聯合應用對細胞活力的影響，用40 nmol/L的BTZ和40 μmol/L的ATRA聯合或單獨處理PANC-1細胞或U2OS細胞24h，MTS實驗檢測細胞活力.結果表明，單獨使用40 nmol/L 的BTZ可以明顯抑制PANC-1和U2OS細胞的生長(P<0.001)，當聯合應用ATRA和BTZ時，細胞活力同樣受到明顯抑制(P<0.001)(圖2，表2).聯合用藥組和ATRA單獨用藥組相比有顯著差異，而與BTZ單獨用藥組相比沒有顯著差異(圖2)，這表明40 μmol/L ATRA對細胞生長的促進作用可被40 nmol/L的BTZ抹平，因此，BTZ可以抑制低濃度ATRA的促生長效應.

表1 不同濃度ATRA處理后 PANC-1和U2OS細胞的活力

圖2 低濃度ATRA單獨或聯合BTZ對PANC-1和U2OS細胞活力的影響

表2 低濃度ATRA單獨或聯合BTZ用藥對PANC-1和U2OS細胞活力的影響

3.3 高濃度ATRA抑制細胞生長的能力可被BTZ增強

為進一步檢測BTZ對ATRA作用的影響，我們繼續(xù)進行了高濃度ATRA聯合BTZ的用藥實驗.采用200 μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ單獨或聯合處理PANC-1或U2OS細胞24 h，MTS實驗檢測細胞活力.結果顯示，高濃度的ATRA可以顯著抑制PANC-1和U2OS細胞的生長(P<0.001)，聯合應用ATRA和BTZ可明顯抑制PANC-1和U2OS細胞的生長(P<0.001)(圖3，表3)，與單獨應用ATRA相比，聯合用藥組都具有顯著差異(PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01)；與單獨應用BTZ相比，聯合用藥同樣具有顯著差異(P<0.01)(圖3).

3.4 ATRA和BTZ聯合用藥可調控凋亡前體蛋白的水平

BTZ能夠可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統以誘導細胞凋亡[20-21].我們的實驗結果表明，在U2OS細胞中， BTZ處理可誘導凋亡蛋白的切割以增加活性Caspase3的水平，并且這種作用呈劑量依賴性.40 μmol/L的ATRA并不影響凋亡前體蛋白Procaspase3的含量和切割成熟(圖4).而40 μmol/L ATRA與40 nmol/L BTZ聯合處理細胞時，雖然并不影響活性Caspase3的水平，卻可以明顯降低凋亡前體蛋白Procaspase3的表達，表明聯合用藥有可能通過非Caspase3切割途徑影響細胞的凋亡.

圖3 高濃度ATRA單獨或聯合BTZ對PANC-1和U2OS細胞活力的影響

表3 高濃度ATRA單獨或聯合BTZ對PANC-1和U2OS細胞活力的影響

圖4 ATRA和BTZ聯合用藥可降低凋亡前體蛋白的水平

ATRA作為一種維生素A的活性代謝物，目前在臨床上用于治療急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].ATRA通常被認為是一種抗癌化療藥物，對多種腫瘤細胞具有殺傷作用.但隨著研究的深入，卻發(fā)現了一些有趣的現象.一些臨床研究表明膳食維甲酸具有促進腫瘤的作用：每天高劑量的β-胡蘿卜素可加速DMBA和TPA -誘導的皮膚乳頭瘤形成并增加腫瘤的產生[12]；給benzo[a]pyrene-治療的倉鼠補充高β-胡蘿卜素飲食增加了其呼吸道癌的發(fā)生率[13]. ATRA衍生物IIF對骨肉瘤細胞和間充質干細胞的生長也呈時間和劑量依賴性，但對U2OS細胞凋亡則沒有明顯影響[7].與這些結果類似的是，我們的結果表明，在胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細胞中，ATRA對細胞活力的影響呈現雙面效應：低濃度促進細胞生長而高濃度則抑制生長.

與我們的結果不同的是，Guo曾報道5～50 μmol/L的ATRA可抑制PANC-1細胞的生長[8].這種不同可能與應用的培養(yǎng)基有關. Guo的實驗采用RPMI-1640培養(yǎng)基，而我們采用的是DMEM培養(yǎng)基.PANC-1細胞在不同培養(yǎng)條件下對ATRA應答方式的不同值得深入研究.

ATRA抑制細胞生長并誘導分化的作用讓它在癌癥治療方面獲得了廣泛的研究，特別是聯合用藥的探索.5 μmol/L ATRA通過增加肝細胞癌腫瘤起始細胞(HCC TICs)分化，能有效增強肝癌細胞對順鉑(cisplatin)的敏感性[3].5 μmol/L ATRA可增加多西他賽(docetaxel)誘導前列腺癌細胞的凋亡[14].在紫杉醇治療之前，將乳腺癌細胞與0.01 μmol/L的ATRA孵育3天，可增強紫杉醇誘導的乳腺癌細胞死亡[15]. 0.1、1和10 μmol/L ATRA能強烈增強As2O3誘導的人肝癌、乳腺癌和肺癌細胞生長的抑制并促進細胞凋亡[16].不同的細胞對ATRA的敏感性不同.在本文中我們發(fā)現，低濃度的ATRA與BTZ聯合應用可以逆轉ATRA的促生長效應，高濃度的ATRA與BTZ聯合應用可以顯著增強ATRA抑制細胞生長的能力，表明在PANC-1和U2OS細胞中，高濃度ATRA和BTZ聯合使用才有顯著的協同作用，增強細胞對化療的敏感性，達到更好的治療效果.