馬夢(mèng)黎 文金隆 莊 彥

云南省玉溪市中醫(yī)醫(yī)院，云南 玉溪 653100

肢傷愈合劑(肢傷1號(hào)合劑)是玉溪市中醫(yī)院在肢傷1號(hào)方的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的新制劑，由川芎、赤芍等7味中藥組成，具有行氣活血、祛瘀止痛的功效，用于氣滯血瘀型骨折創(chuàng)傷早期。肢傷1號(hào)方是在經(jīng)方“四物湯”的基礎(chǔ)上，結(jié)合骨折創(chuàng)作早期的病理特點(diǎn)，經(jīng)臨床實(shí)踐加減化裁而來(lái)。處方分析全方主藥為川芎、赤芍。川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛，是血中氣藥；赤芍清熱涼血、散瘀止痛，善散邪行血?，F(xiàn)代藥理研究表明川芎中的阿魏酸是公認(rèn)的活性成分，具有抗腫瘤、抗菌和舒張血管的作用，在很多制劑中作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的考察指標(biāo)。赤芍抗炎的化學(xué)成分及作用機(jī)制研究主要集中在芍藥苷。為了更好地對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，保證臨床用藥安全有效，本研究對(duì)其中的川芎、赤芍進(jìn)行薄層色譜鑒別研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 YXQ-28OSI手提式壓力蒸汽滅菌器(嘉興市中并報(bào)醫(yī)療儀器有限公司)；KH-50B型超聲波清洗器(昆山和創(chuàng)超聲儀器有限公司)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海安亭電子儀器廠)；HH-S2電熱恒溫水浴鍋；ZBY149-83型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Canon PowerShot G15數(shù)碼照相機(jī)(Canon INC)；

1.2 材料 硅膠G板(MERCK、青島海洋化工、自制板)；試劑均為分析純。阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)：110773-201012)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：11C736-201438)、川芎對(duì)照藥材(批號(hào)：120918-201411)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)：120927-201516)、赤芍對(duì)照藥材(批號(hào)：121092-201003)等均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，肢傷愈合劑(批號(hào)：20150807、20151016、20160526)由玉溪市中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎的薄層鑒別 取本品50 mL，加乙醚振搖提取2次，每次25 mL，合并乙醚液，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材1 g，加水煎煮2次，每次50 mL，煮沸，并保持微沸20 min，脫脂棉濾過(guò)，合并濾液，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。再取阿魏酸對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 赤芍的薄層鑒別 取本品50 mL，加入25 mL經(jīng)水飽和的正丁醇振搖提取，分取正丁醇層，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解(必要時(shí)加中性氧化鋁1 g，攪拌，蒸至近干，殘?jiān)靡掖?0 mL分次洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解)，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 川芎TLC鑒別圖 圖2 赤芍TLC鑒別圖(陰性對(duì)照) 圖3 赤芍TLC鑒別圖(藥材對(duì)照)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)初期逐一對(duì)該制劑中的主要藥味進(jìn)行提取對(duì)照，并制作了相應(yīng)的陰性對(duì)照液一起實(shí)驗(yàn)。綜合制劑的藥理作用和現(xiàn)代有效成份的研究，選擇主藥的主要藥理成分阿魏酸和芍藥苷作為最終對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)以下項(xiàng)目進(jìn)行優(yōu)化。

3.1.1 供試品溶液的提取和前處理對(duì)比 阿魏酸項(xiàng)采用酸性條件下乙醚萃取、乙醚直接萃取作比較，結(jié)果酸性條件下的乙醚萃取液在薄層色譜法中有一明顯灰色干擾斑點(diǎn)，與阿魏酸對(duì)照品的位置較接近。而乙醚直接萃取既減少操作，又可得到較好地結(jié)果。芍藥苷項(xiàng)采用醇提不能清晰地分離出來(lái)，改用正丁醇提取基本可以分離出來(lái)。但在某些批次的產(chǎn)品提取后所得供試液較濃，干擾大。加入中性氧化鋁處理后可得到較好結(jié)果。

3.1.2 展開(kāi)系統(tǒng)優(yōu)化 阿魏酸展開(kāi)劑分別嘗試正己烷-乙酸乙酯(4∶1)(9∶1)、環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酸-甲酸(4∶1∶1∶0.1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.1)(2∶1.5∶0.05)等多種展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)對(duì)比，根據(jù)展開(kāi)顯色效果最終確定展開(kāi)劑甲苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)為展開(kāi)劑。芍藥苷項(xiàng)薄層試驗(yàn)的展開(kāi)經(jīng)驗(yàn)，分別嘗試用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(8∶1∶4∶1)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)多次進(jìn)行展開(kāi)對(duì)比。在實(shí)際工作中，因濃氯試液在貯存過(guò)程因貯存時(shí)間、環(huán)境等原由，會(huì)導(dǎo)致濃氨試液的濃度下降導(dǎo)致影響結(jié)果。最終決定選擇后者作為展開(kāi)劑。

3.1.3 檢視方法選擇 阿魏酸分別嘗試直接觀察、紫外觀察、顯色劑顯色觀察對(duì)所得的薄層板進(jìn)行檢視。最為方便的是紫外燈下檢視，故最終確定為紫外365 nm檢視。芍藥苷項(xiàng)分別嘗試5%香草醛硫酸液、10%硫酸乙醇液、5%硫酸乙醇液顯色。5%香草醛硫酸液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，10%硫酸乙醇液對(duì)霧化器的要求較高。結(jié)合我院制劑實(shí)驗(yàn)室的條件，最終選擇5%硫酸乙醇液。加熱顯色時(shí)選擇105 ℃烤箱加熱、電吹風(fēng)熱風(fēng)逐步加熱作對(duì)比。105 ℃烤箱加熱掌握不好時(shí)間，容易加熱過(guò)導(dǎo)致顯色斑點(diǎn)效果不好，不能看到斑點(diǎn)顯色變化。熱風(fēng)吹則可人為控制加熱程度，更好更明顯地看到斑點(diǎn)的顯現(xiàn)及變化情況。

3.1.4 對(duì)照物質(zhì)的選用 選用相應(yīng)的對(duì)照藥材、對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照。川芎項(xiàng)陰性對(duì)照中阿魏酸對(duì)照品對(duì)應(yīng)的位置顯相同顏色的對(duì)照斑點(diǎn)，所以保留了對(duì)照藥材與對(duì)照品兩項(xiàng)對(duì)照。赤芍項(xiàng)陰性無(wú)干擾，為方便實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)控制，最終標(biāo)準(zhǔn)確定為芍藥苷項(xiàng)，不再保留赤芍對(duì)照藥材。

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 在實(shí)際的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用中，產(chǎn)品批次、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)器材、實(shí)驗(yàn)人等均是標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用的主要影響因素，為使所確定的專屬性薄層項(xiàng)在實(shí)際的應(yīng)用質(zhì)控時(shí)能較好地指控產(chǎn)品質(zhì)量。選擇不同產(chǎn)品批次、不同薄層板、不同的操作者對(duì)該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2.1 薄層板驗(yàn)證 不同薄層板對(duì)實(shí)驗(yàn)的承載量等均有所不同，分離效果亦不相同，所以根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行點(diǎn)樣量的范圍界定。對(duì)比三種薄層板，Merck板的分離度最高，承載量最小，青島板次之。自制板分離度最低，承載量最大，需要加大點(diǎn)樣量方可得到滿意的結(jié)果圖。故而在點(diǎn)樣量中取一個(gè)中間點(diǎn)樣量。

3.2.2 斑點(diǎn)顯色情況 斑點(diǎn)顯色與薄層板、顯色時(shí)間、加熱程度及放置時(shí)間等息息相關(guān)。一般初期的斑點(diǎn)顏色偏艷，放置空氣中較長(zhǎng)時(shí)間后變淡。

綜上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的優(yōu)化與驗(yàn)證，本文建立的肢傷愈合劑的川芎、赤芍的薄層鑒別項(xiàng)色譜斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。實(shí)際應(yīng)用中簡(jiǎn)單方便，重復(fù)性好，可作為肢傷愈合劑的定性鑒別。曾嘗試用高效液相對(duì)其阿魏酸和芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定，因現(xiàn)實(shí)條件等問(wèn)題暫不定為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)?？稍谝院蟮臉?biāo)準(zhǔn)提升中再進(jìn)一步確定。