楊瑩，鄭芳芳，謝成勇，周鋼橋

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)簡稱肝癌，是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第3位，致死率位居第2位，僅次于肺癌[1]。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究均表明，病毒性肝炎與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。肝癌具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、預(yù)后較差的特點(diǎn)[3]。肝癌早期的臨床癥狀一般并不明顯，因此，診斷發(fā)現(xiàn)時絕大多數(shù)已經(jīng)發(fā)展到晚期，治療困難且預(yù)后差。血清腫瘤蛋白標(biāo)志物的檢測是臨床診斷肝癌的重要方法之一，目前被人們熟知的HCC標(biāo)志物包括甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、α-L-巖藻糖苷酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶等[4]。其中，AFP作為肝癌早期診斷標(biāo)記物已被廣泛使用多年，是目前用于肝癌診斷的最佳血清蛋白標(biāo)志物[5]。但是，部分肝癌患者中的AFP水平并不升高；此外，在其他類型的肝臟疾病中，如肝硬化(liver cirrhosis, LC)和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者等，AFP的水平也可能升高[5]。因此，AFP用于肝癌診斷的敏感性和特異性欠佳，導(dǎo)致早期HCC的確診率較低，易出現(xiàn)漏診或誤診，臨床應(yīng)用價值受限[6-7]。因此，尋找新的肝癌診斷生物標(biāo)志物，具有重要的醫(yī)學(xué)意義。

顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)，也稱顆粒狀上皮前體(granulin-epithelin precursor, GEP)，是一種分泌性糖蛋白，也是腫瘤壞死因子受體的配體[8]。PGRN可作為生長因子，在早期胎兒發(fā)育、成人組織修復(fù)、炎癥和腫瘤發(fā)生等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。在多種組織器官中，如皮膚組織、女性生殖器官以及胃腸道系統(tǒng)等，均有PGRN蛋白的表達(dá)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，PGRN蛋白在乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及腎癌等侵襲性腫瘤細(xì)胞株[12-13]，以及卵巢癌和乳腺癌等腫瘤組織中異常高表達(dá)[14-15]，提示PGRN具有作為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛力。既往研究還發(fā)現(xiàn)，在HCC患者腫瘤組織中，PGRN的mRNA表達(dá)顯著高于正常肝組織[16]。此外，PGRN可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長和侵襲[17]。本研究旨在通過測定HCC患者及非HCC人群血清中PGRN的表達(dá)水平，探討其與HCC的臨床病理特征的關(guān)系，以及作為HCC診斷血清標(biāo)志物的潛在臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本項(xiàng)研究招募50例HCC患者(HCC組)，以及性別、年齡與HCC組相匹配的30例正常對照個體(NC組)、20例肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者(LC組)和20例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者(CHB組)。上述個體于2017年12月至2018年1月招募自江蘇省南京市的中國人民解放軍第八一醫(yī)院。HCC患者術(shù)前未接受過放療、化療以及其他治療，臨床診斷符合中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會制定的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[18]，并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)；CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：血清乙型肝炎病毒DNA陽性、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)顯著升高、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗體(HBcAb)陽性持續(xù)6個月以上。LC的診斷由臨床、組織學(xué)、生化或放射學(xué)的結(jié)果確定[19]。每例HCC患者均進(jìn)行了跟蹤隨訪。所有研究對象均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)過北京放射醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

包括純水儀(Thermo Fisher)、無菌超凈臺(北京哈東聯(lián))、離心機(jī)(Eppendorf 5810R)、酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(TECAN)、-80 ℃超低溫冰箱(海爾)、微量移液器(Eppendorf)和EP無菌管(Thermo)等。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本的采集 采集研究對象的外周靜脈血5 ml，置于抗凝采血管中，4 ℃條件下3 000×g離心10 min(若上層液混濁，需要再次離心)，取上層的血清分裝入EP無菌管中，編號后置入-80 ℃超低溫冰箱保存。檢測前避免反復(fù)凍融，直至實(shí)驗(yàn)開始前解凍并調(diào)整至室溫。

1.3.2 血清中PGRN和AFP蛋白含量的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(瑞士TECAN公司)，采用人血清PGRN(美國R&D公司，批號DPGRN0)以及AFP(臺灣Abnova公司，批號KA0202)的ELISA檢測試劑盒，按其操作步驟進(jìn)行。在450 nm波長處測量各樣品孔的光密度(Optical density，OD)值，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各樣品的OD值查出相應(yīng)樣品的濃度。

1.3.3 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的下載和分析 為探索PGRN的表達(dá)在肝癌組織和癌旁組織中是否存在顯著差異，本研究從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus, GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)中下載了2個HCC的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集(GSE55092和GSE121248)。上述2個數(shù)據(jù)集的樣本均使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片檢測mRNA表達(dá)。獲取肝癌組織和癌旁組織中PGRN的mRNA表達(dá)數(shù)值后，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析2組間PGRN的表達(dá)是否存在顯著差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，計算最佳含量截斷點(diǎn)、敏感度、特異度和曲線下面積(area under the curve，AUC)并伴隨95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，診斷的最佳含量截斷點(diǎn)通過將敏感性和特異性之和最大化，并將最佳含量截斷點(diǎn)與ROC曲線左上角的距離最小化來確定。靈敏度=[真陽性例數(shù)/(真陽性+假陰性)例數(shù)]×100%，特異度=[真陰性例數(shù)/(真陰性+假陽性)例數(shù)]×100%。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；不符合正態(tài)分布則采用中位數(shù)(下四分位數(shù)～上四分位數(shù))表示。2組獨(dú)立樣本間均數(shù)的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，可視化采用GraphPad(v7)完成。采用卡方檢驗(yàn)分析PGRN水平與臨床病理特征間的相關(guān)性。計數(shù)資料以例數(shù)或率(%)表示。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGRN在肝癌組織中的表達(dá)

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載2個HCC組織和癌旁肝組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集(GSE55092和GSE121248)。GSE55092中包含了49例HCC組織和91例癌旁肝組織，GSE121248包含了70例HCC組織和37例癌旁肝組織。Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析顯示，這2個數(shù)據(jù)集的HCC組織中PGRN的mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁肝組織(P<0.05)見圖1。這提示PGRN有可能是HCC的候選診斷標(biāo)志物。

注：A為GSE55092中PGRN表達(dá)的差異分析，B為GSE121248中PGRN表達(dá)的差異分析。黑色的水平線表示中位數(shù)或四分位數(shù)間距；P值為Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用min-max法對PGRN的表達(dá)量進(jìn)行了歸一化。GEO為基因綜合表達(dá)數(shù)據(jù)庫，PGRN為顆粒蛋白前體圖1 GEO數(shù)據(jù)集中PGRN在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異分析

2.2 招募的研究對象及其基本特征

各組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；以年齡中位數(shù)53歲分層，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，各組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HCC組的性別分布比例與NC組、CHB組和LC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 招募的研究對象基本特征(例)

2.3 各組樣本中PGRN和AFP的血清濃度水平

正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，AFP和PGRN濃度水平不符合正態(tài)分布，使用M(P25～P75)描述數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC組的血清AFP水平顯著高于NC組和LC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；HCC組的血清PGRN水平顯著高于NC組、LC組和CHB組44.94 (34.03～70.17) ng/ml，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2和圖2。上述結(jié)果進(jìn)一步提示，PGRN可能是候選的HCC診斷血清標(biāo)志物。

表2 各組樣本中血清PGRN和AFP的水平[ng/ml, M(P25～P75)]

注：A為各組樣本中PGRN水平差異情況，B為各組樣本中AFP水平差異情況。黑色的水平線表示中位數(shù)或四分位數(shù)間距。AFP為甲胎蛋白，PGRN為顆粒蛋白前體，CHB為慢性乙型肝炎，HCC為肝癌，LC為肝硬化，NC為正常對照圖2 各組樣本中血清PGRN和AFP水平的差異

2.4 PGRN和AFP單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測HCC的ROC曲線

通過構(gòu)建ROC曲線，本研究進(jìn)一步評估了AFP、PGRN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對HCC的診斷價值。根據(jù)ROC曲線，AFP或PGRN單獨(dú)檢測(P值均<0.05)，HCC診斷的最佳截斷點(diǎn)分別為287.84 ng/ml和51.93 ng/ml。AFP和PGRN聯(lián)合檢測，HCC診斷的靈敏度為92.0%，高于AFP和PGRN單獨(dú)檢測；AFP和PGRN聯(lián)合檢測的特異度為96.9%，高于AFP和PGRN單獨(dú)檢測；AFP和PGRN聯(lián)合檢測的AUC為0.97，高于AFP和PGRN單獨(dú)檢測。見表3和圖3。上述結(jié)果提示，PGRN可能是早期診斷HCC的候選血清標(biāo)志物，且AFP和PGRN聯(lián)合檢測可能具有更高的診斷價值。

表3 血清AFP、PGRN單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測對HCC診斷價值的比較

注：藍(lán)色為AFP單獨(dú)檢測診斷HCC的ROC曲線，綠色為PGRN單獨(dú)檢測HCC的ROC曲線，紅色為AFP和PGRN聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線。AFP為甲胎蛋白，PGRN為顆粒蛋白前體，ROC為受試者工作特征曲線，HCC為肝癌圖3 AFP和PGRN單獨(dú)及聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線

2.5 HCC患者血清PGRN水平與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性分析

根據(jù)HCC患者血清PGRN濃度中位數(shù)(74.12 ng/ml)，本研究將HCC患者分為PGRN高表達(dá)組(n=25)和PGRN低表達(dá)組(n=25)，并分析了HCC患者血清PGRN水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC患者血清PGRN蛋白水平與患者的年齡、性別、是否HBV感染、是否伴有肝硬化以及血清中AFP蛋白水平均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 HCC患者血清PGRN水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析(例)

3 討論

本研究檢測了NC組、CHB組、LC組和HCC組血清中PGRN水平，并評估了其診斷性能。結(jié)果顯示，HCC組的血清PGRN水平均顯著高于NC組、CHB組、LC組，表明PGRN在HCC的診斷中具有潛在的臨床應(yīng)用價值。此外，標(biāo)志物PGRN和AFP聯(lián)合檢測時的AUC、靈敏度和特異度，較AFP或PGRN單獨(dú)檢測時更加顯著，提示PGRN和AFP聯(lián)合檢測，可能有助于早期診斷HCC，減少漏診，增強(qiáng)篩查效果，對HCC高危人群的篩查具有重要意義。

PGRN基因定位于染色體17q21.32，全長約4 kb，含12個外顯子[20]。該基因編碼的PGRN蛋白由593個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為68 500 Da，經(jīng)糖基化修飾后相對分子質(zhì)量為90 000 Da。PGRN蛋白在人體各類組織或細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其是在快速分裂的細(xì)胞中，如皮膚成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等[11]。該蛋白能夠調(diào)控上述細(xì)胞的生長、分裂和存活[11]。在腫瘤相關(guān)研究中，絕大部分上皮組織來源的腫瘤細(xì)胞(如卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞等)中，PGRN蛋白均顯著上調(diào)[11]。在肝癌研究中，肝癌組織與鄰近的癌旁非HCC組織相比，PGRN的轉(zhuǎn)錄水平也顯著上升[21]。這提示PGRN蛋白有望成為HCC的臨床診斷候選標(biāo)志物。

目前，HCC的臨床診斷主要依靠血清中腫瘤標(biāo)志物的檢測[22]。腫瘤標(biāo)志物檢測的結(jié)果將有助于指導(dǎo)醫(yī)生進(jìn)行早期的發(fā)現(xiàn)、干預(yù)和治療，以及改善患者的預(yù)后生存狀態(tài)[23]。在過去十年里，雖然多種類型的血清檢測標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)可能能夠用于腫瘤檢測，如血清游離DNA突變，血清游離DNA甲基化等[24-25]。然而，血清蛋白標(biāo)志物，因其血清需要量少、對操作人員的專業(yè)知識依賴性低、成本低、重復(fù)性高、樣品不需要預(yù)處理等優(yōu)勢，仍是最適用于臨床常規(guī)檢測的標(biāo)志物[25-27]。因此，積極探尋新的HCC蛋白標(biāo)志物，成為臨床研究的重點(diǎn)[28]。除AFP外，高爾基體蛋白73和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在肝癌的臨床檢測和診斷中也有一定的應(yīng)用[29]。但上述標(biāo)志物均不能100%檢測出早期HCC，臨床診斷價值具有一定的局限性，迄今為止也尚未發(fā)現(xiàn)一種血清腫瘤標(biāo)志物能夠100%檢測出早期HCC[30]。標(biāo)志物聯(lián)合診斷研究發(fā)現(xiàn)，采用多種標(biāo)志物對腫瘤患者進(jìn)行診斷，能夠顯著提高臨床診斷的正確率[31]。AFP與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可提高肝癌的檢測效率，對于提高HCC患者的預(yù)后和生存率具有重要意義[32]。本項(xiàng)研究中也證實(shí)了PGRN與AFP聯(lián)合檢測HCC的效果要優(yōu)于AFP或PGRN單獨(dú)檢測，這一結(jié)果提示可采用PGRN和AFP聯(lián)合檢測，以提升早期HCC患者的檢出率。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PGRN和AFP聯(lián)合檢測下的AUC、靈敏度和特異度均高于單獨(dú)檢測，提示PGRN有望成為HCC早期診斷的血清標(biāo)志物，與AFP聯(lián)合檢測增強(qiáng)早期HCC篩查能力。今后仍需進(jìn)一步的多中心、大人群的驗(yàn)證工作，以確證PGRN作為HCC早期診斷血清標(biāo)志物的潛力。