張欣怡 楊艷妮 姬笑顏 李含笑 劉西紡,2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院研究生院，咸陽 712046)(2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院神經(jīng)脊柱病區(qū)，西安 710054)

頸肩腰腿痛是常見的肌肉骨骼系統(tǒng)病痛，給個人、家庭和社會帶來一定的精神壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。其預(yù)防、發(fā)病機制及治療一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點。雖然多種因素均可引起頸肩腰腿痛的發(fā)生，但椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是其發(fā)病的主要原因之一[1]。椎間盤是人體最大的無血管結(jié)構(gòu)，由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板構(gòu)成，為脊柱的運動和負(fù)荷提供結(jié)構(gòu)支撐。椎間盤退變的原因復(fù)雜多樣，主要包括衰老、機械壓力、吸煙、肥胖、感染、創(chuàng)傷、遺傳等。退變的椎間盤表現(xiàn)出椎間高度的降低、纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙或斷裂、髓核膠原蛋白和水分的丟失、椎體終板的鈣化等結(jié)構(gòu)的改變，繼而出現(xiàn)膨出、突出、脫垂等病理變化，在相應(yīng)部位出現(xiàn)頸肩部疼痛、腰腿痛等臨床表現(xiàn)。利用椎間盤退變動物模型可以經(jīng)濟有效地進行病因病機和治療方法的研究。因此，建立操作簡便、可控性強、符合人類解剖及生理特征且能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律的動物模型有助于開展醫(yī)學(xué)實驗研究。對目前主要的椎間盤退變模型進行分類歸納及總結(jié)，以期為研究者選取椎間盤退變動物模型提供參考。

1 實驗動物的選擇

模型動物的選擇直接影響動物模型的構(gòu)建效果，因此模型動物的選擇具有十分重要的意義。動物模型的制備對于了解疾病的產(chǎn)生機制及作用過程具有相當(dāng)重要的作用。這就要求動物模型必須是合乎倫理的、可控制的、具有重復(fù)性和成本效益，并且能夠充分模擬正在研究的人類病理過程[2]。椎間盤退變動物模型應(yīng)能夠再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律，截至目前用于構(gòu)建椎間盤退變的動物有10多種，主要包括鼠、兔、羊、犬、豬、猴、狒狒等。由于鼠和兔來源充足、易于飼養(yǎng)、品種純正、實驗成本低等優(yōu)點，是椎間盤退變模型的首選動物，但其脊柱構(gòu)造及生物力學(xué)特性與人類有一定的差異。其中由于小鼠體型小，生命力較弱，對手術(shù)的耐受性差，在模型制作過程中死亡率也較高。因此，鼠和兔作為椎間盤退變的模型動物也具有一定的局限性。羊、豬、犬等大型哺乳動物的椎間盤與人類椎間盤在大小上合適，但其為四足動物，椎間盤受力與人類不一致而無法體現(xiàn)力學(xué)因素在椎間盤退變過程中的重要作用，雖然有研究者采用人為辦法迫使其直立行走，但由于經(jīng)濟成本高、技術(shù)要求嚴(yán)格、飼養(yǎng)不便等缺點，未在椎間盤退變動物模型構(gòu)建過程中大量使用。靈長類動物是人類椎間盤退變研究最理想的選擇，其與人類一樣都是雙足直立行走，椎間盤結(jié)構(gòu)及受力環(huán)境與人類高度相似，但由于價格昂貴及動物實驗倫理道德等因素限制，無法得到廣泛應(yīng)用。不同的實驗項目有不同的目的和要求，因而每項研究都應(yīng)該選擇最合適的實驗動物，從而以最小的代價獲得最好的結(jié)果。每種動物有不同的生理特點，根據(jù)實驗?zāi)康摹嶒灄l件及經(jīng)費預(yù)算等進行模型動物的選擇。

2 模型建立的方法

2.1 誘發(fā)性椎間盤退變動物模型

2.1.1結(jié)構(gòu)損傷模型

2.1.1.1 機械損傷模型：機械損傷主要通過外科手術(shù)干擾髓核、纖維環(huán)及軟骨終板引起椎間盤的退變。其中細(xì)針穿刺法因操作簡便、造模結(jié)果可靠、椎間盤退變程度易于控制而得到廣泛的應(yīng)用。Kim等[3]使用18G、21G和23G三種不同型號的穿刺針在透視引導(dǎo)下行兔L3～L4、L4～L5及L5～L6椎間盤纖維環(huán)穿刺結(jié)合髓核抽吸發(fā)現(xiàn)，21G穿刺技術(shù)在較短的時間內(nèi)造成椎間盤退變的效果更好。Glaeser等[4]在大鼠椎間盤退變模型的優(yōu)化研究中也發(fā)現(xiàn)21G穿刺技術(shù)致椎間盤退變的效果及可重復(fù)性均較好。損傷髓核與纖維環(huán)致退行性變發(fā)展緩慢便于觀察及干預(yù), 其穿刺針的型號、進針的深度需要進行精確計算，其最大的缺點是髓核組織丟失導(dǎo)致發(fā)生退行性變的過程與自然退行性變有較大的差別，不能全面反映椎間盤退行性變機制[5]。Vadala等[6]通過對12只成年綿羊經(jīng)椎弓根入路，從終板向髓核鉆2 mm的通道，進行部分髓核切除術(shù)，建立了一個纖維環(huán)完整的椎間盤逐步退變的動物模型，可用于研究髓核再生及早期輕度椎間盤退變的再生修復(fù)。軟骨終板是椎間盤獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要通道，軟骨終板的損傷也會引起椎間盤的退變。無水乙醇是微循環(huán)破壞試劑，具有去血管化作用，終板下注射可阻礙椎體-終板營養(yǎng)[7]。白榮飛等[8]通過針刺纖維環(huán)、終板注射無水乙醇及針刺聯(lián)合終板注射三種方法建立大鼠椎間盤退變模型，從椎間盤相對高度、椎間盤組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色評價椎間盤退變，發(fā)現(xiàn)終板注射法較針刺纖維環(huán)法更早引起退變，12周后兩種造模方法無顯著差異，而聯(lián)合組則可明顯加快并加重椎間盤的退變并有效縮短實驗周期。

2.1.1.2 化學(xué)損傷模型：化學(xué)損傷法是將一些化學(xué)物質(zhì)注入椎間盤，引起髓核和纖維環(huán)的損傷或變性，從而達(dá)到椎間盤退變的目的。Lotz[9]向鼠椎間盤髓核內(nèi)注射木瓜凝乳蛋白，3周后發(fā)現(xiàn)椎間隙變窄、磁共振T2加權(quán)像信號強度降低，提示椎間盤發(fā)生退變。Muramatsu等[10]將糖胺聚糖降解酶——condoliase注射入食蟹猴椎間盤中，引起了髓核、纖維環(huán)、軟骨終板和骨骺生長板的退變和壞死；骨骺生長板灶性消失以及軟骨終板的新生血管化和骨化，與木瓜凝乳蛋白酶引起的變化在性質(zhì)上相似，但范圍更加廣泛。Hoogendoorn等[11]向羊椎間盤內(nèi)注射0.25 U/mL軟骨素酶ABC致髓核蛋白多糖裂解，且羊椎間盤內(nèi)缺乏脊索細(xì)胞，與人類椎間盤相似，在18周內(nèi)成功建立了一種緩慢的、可重復(fù)性的且與人類椎間盤退變相似性極強的椎間盤退變模型。Liu等[12]利用微創(chuàng)微量注射技術(shù)將FN-f注射到兔椎間盤中，通過上調(diào)MMPs、iNOS及TNF-1導(dǎo)致軟骨損傷，在4周時開始出現(xiàn)早期退變，后期髓核被纖維組織完全替代，成功建立了重復(fù)性好、操作簡便且性價比高的椎間盤退變模型。Wei等[13-14]將博來霉素經(jīng)皮注射到恒河猴鄰近椎間盤的軟骨下或在CT引導(dǎo)下將平陽霉素注射到兔腰椎間盤鄰近的軟骨下骨中,采用影像學(xué)、組織化學(xué)和分子生物學(xué)等方法評估椎間盤退變，成功誘導(dǎo)與人類椎間盤退變相似的缺血性慢進性椎間盤退變模型。

2.1.2力學(xué)改變模型

2.1.2.1 應(yīng)力改變模型：生物力學(xué)在椎間盤退變過程中具有重要作用。在生理情況下椎間盤承受身體的垂直靜壓力及在運動過程中的水平剪切力，維持椎間隙高度使相鄰兩椎體的活動度在正常范圍內(nèi)。異常的力學(xué)會導(dǎo)致椎間盤內(nèi)反常的力分布和滲透壓平衡的破壞，被認(rèn)為是椎間盤退變的重要發(fā)病因素[15]。Lao等[16]發(fā)現(xiàn)小鼠在用下肢站立和跳躍時的運動模式與人類相似，采用自制熱板籠提供脊柱軸向生物力學(xué)載荷，隨著時間的延長和生物力學(xué)載荷的增加，纖維環(huán)處裂隙逐漸增大，椎間盤和軟骨終板高度均降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分改變，形成退變模型。Ao等[17]是利用小鼠的恐水性，在有限的含水空間內(nèi)誘導(dǎo)小鼠主動采取兩足站立姿勢，10周后椎間盤退變嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為纖維環(huán)和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的退變，成功建立了一種無創(chuàng)的、有效的與人類相似的椎間盤退變小鼠模型。Wang等[18]通過椎弓根螺釘和棒植入固定羊L3～L4椎間盤，保持椎間盤完整、軟骨終板未被破壞，導(dǎo)致其椎間盤負(fù)荷環(huán)境發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)椎間盤的退變。Xia等[19]在大鼠尾椎中經(jīng)皮插入兩根克氏針，使尾椎彎曲而施以靜態(tài)壓縮載荷，他們發(fā)現(xiàn)隨著負(fù)荷量的增加，靜態(tài)壓迫導(dǎo)致MRI T2加權(quán)像上細(xì)胞核強度進行性降低，聚集素和Ⅱ型膠原表達(dá)減少，MMP-3和MMP-13表達(dá)增加，組織形態(tài)發(fā)生變性，形成了退變模型。

2.1.2.2 脊柱失穩(wěn)模型：此類模型是通過破壞椎間盤周圍結(jié)構(gòu)，打破脊柱的動靜態(tài)平衡，使脊柱過度運動而產(chǎn)生脊柱不穩(wěn)。付方達(dá)等[20]通過手術(shù)去除小鼠棘上和棘間韌帶致其脊柱軸線力學(xué)失穩(wěn)來誘導(dǎo)構(gòu)建椎間盤退變模型，術(shù)后4周見椎間盤高度明顯下降、纖維環(huán)排列紊亂、MMP-13表達(dá)增加等，出現(xiàn)椎間盤退變特征，成功建立椎間盤退變小鼠模型。Fukui等[21]通過完全切除L4～L5雙側(cè)小關(guān)節(jié)，術(shù)后7周發(fā)現(xiàn)L4～L5節(jié)段椎間盤高度增加，終板不規(guī)則，相鄰節(jié)段椎間盤高度降低，組織學(xué)評分高于對照組，出現(xiàn)椎間盤退變征象。

2.1.3基因敲除模型:近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因?qū)ψ甸g盤的重要作用可以從各種轉(zhuǎn)基因鼠中得到證實，為椎間盤退變提供了新的選擇。有研究[22-23]描述了一種SPARC基因缺失小鼠，早在3個月大的時候就出現(xiàn)了運動引起的不適跡象及下背部和后掌對冷刺激的超敏反應(yīng)，且椎間盤退變程度隨著年齡的增長而發(fā)展，可作為椎間盤退變所致慢性疼痛的重要動物模型。Lin等[24]研究發(fā)現(xiàn)一種肌腱/韌帶特異性標(biāo)志物和抗血管生成因子——Tnmd基因敲除小鼠，早在6月齡時出現(xiàn)椎間盤退變征象，同時報道了Tnmd和Chm1雙基因敲除小鼠不僅表現(xiàn)出加速的椎間盤退變,而且還表現(xiàn)出椎間盤的異位成骨。Wu等[25]研究HIF-1a基因在小鼠椎間盤退變中的作用，結(jié)果顯示基因敲除組小鼠椎骨內(nèi)糖胺聚糖減少及Ⅱ型膠原蛋白減少和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)減少。特定基因敲除模型證明了遺傳或基因因素是導(dǎo)致椎間盤退變的因素之一，但其只強調(diào)了某個單一基因的作用，且其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、可重復(fù)性不佳及模型受限，所以該領(lǐng)域研究相對較少。

2.1.4缺血模型:椎間盤無血管結(jié)構(gòu)，是從相鄰椎體的血管網(wǎng)絡(luò)接受其營養(yǎng)物質(zhì)及進行代謝物質(zhì)的交換，骨性終板為營養(yǎng)物質(zhì)向椎間盤的輸送提供了主要途徑[26-27]。之前有研究在犬模型中，用骨水泥堵塞終板營養(yǎng)通路長達(dá)70周，并且沒有發(fā)現(xiàn)椎間盤產(chǎn)生明顯的退變[28]。Kang等[29]證明在幼豬模型中，通過骨水泥干預(yù)阻斷雙側(cè)終板通路3個月后引起椎間盤退變，但其阻斷終板營養(yǎng)通路對椎間盤退變的影響尚不清楚，也存在爭議。現(xiàn)有研究者[30-31]向山羊的兩個腰椎間盤(L2～L3和L3～L4)注射骨水泥阻斷雙側(cè)終板營養(yǎng)通路，干預(yù)48周后，椎間盤出現(xiàn)嚴(yán)重退變，建立了骨水泥注射阻斷雙終板營養(yǎng)通路的成熟山羊模型。雖然缺血性干預(yù)措施的長期作用還有待觀察，但它提示了營養(yǎng)障礙在椎間盤退變中起作用的重要信息。此外，缺血模型對于評估新的椎間盤退變和修復(fù)的生物學(xué)干預(yù)措施也有重要意義。

2.1.5其他模型:吸煙被認(rèn)為是椎間盤退變的主要危險因素之一[32-33]。Iwahashi等[34]將稀釋后的尼古丁溶液注射到兔皮下8周后發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞破壞、纖維環(huán)紊亂及蛋白多糖的合成減少，提示尼古丁毒性導(dǎo)致了椎間盤的退變。吳磊磊等[35]通過對大鼠皮下注射尼古丁，5周后同樣發(fā)現(xiàn)椎間盤退變的征象，并且指出尼古丁加速椎間盤退變的機制可能與抑制AQP1及AQP3表達(dá)有關(guān)。Fields等[36]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了椎間盤軟骨終板細(xì)胞代謝障礙、骨化和生物力學(xué)行為變化等退變征象。

2.2 自發(fā)性椎間盤退變動物模型

Silberberg等[37]首先發(fā)現(xiàn)了與人類椎間盤退變相似的地中海沙鼠椎間盤的變化，認(rèn)為沙鼠高鹽少水的飲食引起代謝產(chǎn)生一定的變化，從而引起椎間盤的退變尤其是髓核功能的異常。沙鼠椎間盤退變發(fā)生早、發(fā)生率高且有一定的遺傳傾向。自發(fā)性椎間盤退變模型與年齡有一定的關(guān)系，Ohnishi等[38]通過Pfirrmann分級、MRI成像和椎間盤組織學(xué)評分發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠在14月齡時開始出現(xiàn)輕度椎間盤退變，22月齡時退變程度達(dá)到中重度。Vincent等[39]也發(fā)現(xiàn)與3月齡和12月齡的小鼠相比，24月齡的小鼠表現(xiàn)出典型的椎間盤退變。Choi等[40]首次報道了SM/J小鼠，在椎間盤退變自發(fā)性SM/J小鼠中，髓核細(xì)胞減少、基質(zhì)成分改變、椎間盤高度降低、椎體骨質(zhì)量差等，概括了人類椎間盤退變的許多顯著特征，是一種新的椎間盤退變小動物模型。此類模型在一定程度上減少了人為因素的影響，但其退變原因及致病機理尚不清楚，在作為動物模型的應(yīng)用中受到了限制。

3 小結(jié)與展望

椎間盤退變是頸肩腰腿痛的病理基礎(chǔ)，椎間盤退變性疾病可以歸入中醫(yī)“痹癥”范疇。由椎間盤退變引起的頸肩腰腿痛，肝和腎與其有較為密切的關(guān)系，肝主筋、腎主骨且精血同源，肝腎虧損是椎間盤退變的病機之一。椎間盤退變模型研究發(fā)展迅速，但鑒于人類椎間盤退變是隨著年齡增長而發(fā)生的復(fù)雜性退行性變化，實驗動物模型與臨床中人的椎間盤退變有很大差異。目前尚沒有一種模型可以完全復(fù)制人類椎間盤退變，每一種椎間盤退變模型都有其局限性。

在現(xiàn)有研究中，椎間盤結(jié)構(gòu)損傷模型最為常見，其中細(xì)針穿刺法因操作易行、重復(fù)性好及造模時間相對較短等優(yōu)點，成為研究椎間盤退變的常用手段，但其模型不適用于早期干預(yù)研究。自發(fā)性椎間盤退變模型因與人類椎間盤退變相似度較高，是研究人類椎間盤退變的有利選擇，但由于動物物種和數(shù)量的限制，其使用并不廣泛。雖然每一種動物模型都有其局限性，但根據(jù)不同的研究需求我們可以選擇更具優(yōu)勢的動物模型。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及研究者們對椎間盤退變的不斷深入了解與探索，對椎間盤退變的動物實驗研究不僅限于西醫(yī)以“病”來建立模型，還可以根據(jù)中醫(yī)不同的證型來建立模型，相信一定會構(gòu)建出一種比較規(guī)范且與人類椎間盤退變相似的理想椎間盤退變動物模型，以期為臨床預(yù)防和治療人類椎間盤退變提供堅實的研究基礎(chǔ)。