石曉玲 賈 偉

(湖北省黃石市中心醫(yī)院普愛(ài)院區(qū)麻醉科，黃石 435001)

炎性疼痛是一種慢性病理性疼痛，可能通過(guò)外傷、手術(shù)、腫瘤等引起局部組織炎癥損傷，造成病理性疼痛[1]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein，ERK)，包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，是MAPKs家族主要成員之一，參與細(xì)胞編碼相關(guān)基因和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在神經(jīng)系統(tǒng)中的激活與各種疼痛的誘發(fā)以及維持都密切相關(guān)[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，甲醛注射后脊髓組織神經(jīng)元中ERK1/2磷酸化水平升高，減少ERK1/2磷酸化水平可對(duì)甲醛誘導(dǎo)的炎癥性疼痛起一定的抑制作用[4]。氫嗎啡酮(hydromorphine，HM)是一種半合成的阿片受體激動(dòng)藥，具有起效快、鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[5]。本研究探討炎性痛大鼠脊髓ERK1/2信號(hào)通路的變化及HM的鎮(zhèn)痛作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性大鼠30只，8～12周齡，體質(zhì)量180～240 g，購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。

1.1.2主要試劑：HM(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；von Frey纖維毛(IITC)；弗氏完全佐劑(CFA)(Sigma)；DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；ERK1/2、GAPDH普通PCR上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；抗ERK1/2、p-ERK1/2抗體、山羊抗兔二抗(LI-COR)；TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 建立動(dòng)物模型及分組

將SPF級(jí)雄性大鼠30只，隨機(jī)分為3組，正常組、模型組和HM組。取20只大鼠，將大鼠麻醉后固定，于右側(cè)足底皮下注射CFA(0.1 mL/只)，建立炎性痛大鼠模型。正常組將大鼠麻醉后，于右側(cè)足底皮下注射等量生理鹽水。模型組大鼠注射足出現(xiàn)縮足、紅腫、舔爪等自發(fā)痛行為表示建模成功。模型建立后隨機(jī)分為兩組，HM組：在造模1 d后，腹腔注射0.3 μmol/L HM；模型組：注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射7 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1各組大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾測(cè)定：根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，熱痛閾測(cè)定：測(cè)定大鼠足底部的熱痛反應(yīng)潛伏期，以此表示熱痛閾。機(jī)械痛閾測(cè)定：采用不同標(biāo)號(hào)的von Frey纖維毛測(cè)定大鼠反應(yīng)閾值，von Frey纖維毛垂直刺激后爪足底部，彎曲至近似90°持續(xù)5 s。躲避反應(yīng)包括大鼠后足抬起、延遲放落、抖動(dòng)及舔食后足或逃避，均被認(rèn)為陽(yáng)性。

1.3.2血清及脊髓取材：在注射0.3 μmol/L HM后對(duì)全部大鼠進(jìn)行取材，1%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，4 000 r/min 離心15 min，取上層血清。取血后暴露心臟，插管灌流固定，先以0.9%氯化鈉溶液灌流，再以4%多聚甲醛灌流至四肢僵硬，暴露脊髓后，取出L4～L6損傷側(cè)組織。

1.3.3各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量：ELISA試劑盒方法測(cè)定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量。

1.3.4Western blot檢測(cè)各組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平：取脊髓組織加入RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1 h，TBST洗膜后加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h后，使用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，于暗室成像拍照，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J分析軟件計(jì)算各組大鼠中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平：TRIzol法提取脊髓總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠脊髓中ERK1/2基因的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下：ERK1/2上游5′-CTCAAGCCTTCCAACCTC-3′，下游5′-TTCCACGGCA CCTTATTT-3′；GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGG TGTCAACGGATT-3′，下游5′-GATGCCAAAGTTGTC ATGGATGACC-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。每組ERK1/2基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

在模型建立時(shí)，模型組和HM組大鼠各死亡1只。模型組大鼠注射部位皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)及腫脹，右后爪收縮抬高；注射HM后，大鼠注射部位皮膚炎癥反應(yīng)減輕，紅色斑點(diǎn)及腫脹減少。

2.2 各組大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾測(cè)定

與正常組相比，模型組大鼠右后肢熱痛閾顯著縮短、機(jī)械痛域明顯降低(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，HM組熱痛閾顯著延長(zhǎng)、機(jī)械痛域明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1所列。

表1 各組大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾比較

2.3 血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量比較

ELISA結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量明顯增高，IL-10含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。注射HM后，大鼠血清TNF-α和IL-6含量顯著降低而IL-10含量顯著升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2所列。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量(μg/L)

2.4 脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平

與正常組相比，模型組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，HM組ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。如圖1所示。

圖1 各組大鼠脊髓中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平

2.5 脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平

與正常組相比，模型組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，HM組ERK1/2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。如圖2所示。

圖2 各組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平

3 討論

炎性痛廣泛存在于各種急慢性疾病進(jìn)程中，臨床主要表現(xiàn)為感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[7]。當(dāng)炎性疼痛產(chǎn)生時(shí)，傷害性刺激可引起外周組織分泌多種細(xì)胞因子，炎性細(xì)胞因子在病理性疼痛中起著非常重要的作用，可產(chǎn)生痛覺(jué)敏感[8]。眭明紅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CFA所致的炎性痛動(dòng)物模型可簡(jiǎn)單重復(fù)并能準(zhǔn)確反映炎性痛的臨床癥狀。本研究通過(guò)足底注射CFA構(gòu)建炎性痛模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠注射部位皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)及腫脹，右后爪收縮抬高；與正常組相比，模型組大鼠術(shù)側(cè)后肢熱痛閾顯著縮短、機(jī)械痛域明顯降低。ELISA結(jié)果顯示模型組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量明顯增高，提示CFA可明顯刺激機(jī)體炎性細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)大鼠建模側(cè)后足熱痛敏和機(jī)械痛敏。

ERK1/2信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致疼痛的形成，磷酸化后的ERK可將胞外信號(hào)傳到核內(nèi)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)通路參與了多種疼痛模型(辣椒素或完全弗氏佐劑致炎、內(nèi)臟痛、電刺激等)[11-12]。在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)ERK1/2磷酸化水平升高，參與坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠的痛敏調(diào)節(jié)[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示炎性痛大鼠ERK1/2信號(hào)通路被激活。

氫嗎啡酮是一種比嗎啡更有效的阿片受體激動(dòng)劑，已經(jīng)廣泛用于急慢性疼痛的治療[14]。牛富國(guó)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HM能夠減少剖宮產(chǎn)術(shù)后產(chǎn)婦血清中疼痛物質(zhì)、炎性因子和應(yīng)激激素的釋放，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究在造模1 d后腹腔注射HM，結(jié)果顯示大鼠注射部位皮膚炎癥反應(yīng)減輕，紅色斑點(diǎn)及腫脹減少；與模型組相比，HM組大鼠血清TNF-α和IL-6含量顯著降低而IL-10含量顯著升高，且熱痛閾顯著延長(zhǎng)及機(jī)械痛域明顯升高；注射HM后，大鼠脊髓中ERK1/2 mRNA表達(dá)水平及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示HM可有效地抑制大鼠機(jī)體炎癥水平，降低痛覺(jué)敏感強(qiáng)度，并能夠降低ERK1/2蛋白磷酸化水平，從而抑制ERK1/2信號(hào)通路的活化，可能是其改善大鼠炎癥痛的作用機(jī)制。

綜上所述，HM可有效改善CFA誘導(dǎo)的大鼠炎性疼痛，其抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制與降低大鼠機(jī)體炎性因子的產(chǎn)生并抑制ERK1/2信號(hào)通路的活化有關(guān)。