劉珍清 趙媛媛 任一冉 張美齡 劉 穎

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)(2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

止血、抗凝等藥物的藥效評(píng)估以及新藥的安全性評(píng)價(jià)一般需要對(duì)凝血四項(xiàng)參數(shù)：凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)一步監(jiān)測(cè)止血和抗凝等藥物的療效、其可能作用的凝血通路以及新藥潛在的毒性反應(yīng)等[1-2]。因此，凝血四項(xiàng)指標(biāo)的可靠性與準(zhǔn)確性將會(huì)對(duì)最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生直接的影響。實(shí)驗(yàn)室檢查中對(duì)PT、APTT、TT和FIB的檢測(cè)實(shí)際上是監(jiān)測(cè)一系列酶促反應(yīng)終點(diǎn)的過程，故從取材到最終指標(biāo)檢測(cè)的整個(gè)過程中，大鼠的取血方式、血樣是否溶血、標(biāo)本量、抗凝劑的品牌等眾多的因素皆會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾[3-5]。目前，尚未見有關(guān)SD大鼠凝血四項(xiàng)檢查正常參考值范圍的報(bào)道。因此，建立本實(shí)驗(yàn)室凝血四項(xiàng)檢查參考值范圍，對(duì)規(guī)范基礎(chǔ)藥理學(xué)研究和新藥研究具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量(190±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠在同一環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，12 h/12 h明暗飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物禁食不禁水12 h。倫理審查編號(hào)：BUCM-4-2019041802-2090。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Sysmex CA-550型全自動(dòng)凝血分析儀(日本希森美康公司)；HC-2518R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

質(zhì)控液、定標(biāo)液和凝血四項(xiàng)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自希森美康生物科技(無錫)有限公司。凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑(凝固法)，批號(hào)：R8038；活化部分凝血活酶測(cè)定試劑(凝固法)，批號(hào)：R8034；凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑(凝固法)，批號(hào)：48123；纖維蛋白原測(cè)定試劑(凝固法)，批號(hào)：R8043；緩沖液，批號(hào)：R6009；氯化鈣溶液，批號(hào)：R6010；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，批號(hào)：20180523；3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑(上海源葉生物科技有限公司)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

40只SD大鼠標(biāo)號(hào)稱質(zhì)量后，以水合氯醛(40 mg/kg)將大鼠麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血，并按照9∶1的比例與3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑混合均勻，以3 000 r/min離心15 min，取出上層血漿，利用全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)PT、APTT、TT和FIB四項(xiàng)指標(biāo)，檢測(cè)需要在2 h之內(nèi)完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

SD大鼠凝血四項(xiàng)的檢測(cè)結(jié)果見表1所列。

表1 SD大鼠PT、APTT、TT和FIB測(cè)定結(jié)果

3 討論

凝血四項(xiàng)檢查不但是臨床用于凝血功能初篩的參數(shù)，同時(shí)也是實(shí)驗(yàn)室中止血和凝血等相關(guān)藥物研究和安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[5]。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，凝血四項(xiàng)檢查已經(jīng)不單單應(yīng)用于出血或者凝血等疾病的診斷范疇，對(duì)肝炎、肝硬化、妊娠高血壓等多種疾病的診斷也具有很大的臨床價(jià)值[6-9]。凝血四項(xiàng)參數(shù)中的PT既可以反映機(jī)體的外源性凝血通路，包括凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ和Ⅱ的含量及其活性，也可以用來監(jiān)測(cè)彌漫性血管內(nèi)凝血和肝臟蛋白質(zhì)合成成功與否。本研究采用凝固法，通過向待測(cè)血漿中加入氯化鈣和組織因子來觀察其凝固需要的時(shí)間從而獲取SD大鼠的正常PT值范圍。APTT可以初步反映機(jī)體的內(nèi)源性凝血通路和篩查凝血因子(Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)是否缺乏，還可用于狼瘡抗凝物、監(jiān)測(cè)肝素抗凝治療等的監(jiān)測(cè)[10]，是當(dāng)前抗凝藥物檢查的重要指標(biāo)。TT既是低(或無)FIB血癥以及異常纖維蛋白血癥等FIB減少的指標(biāo)，同時(shí)也可以用于衡量纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物是否增高。臨床上多用于肝素治療檢測(cè)，也用于活血化瘀藥物、止血藥物[11-12]等藥效的檢測(cè)。另外，F(xiàn)IB作為肝臟合成的凝血因子，是血凝塊能夠穩(wěn)定形成的重要結(jié)構(gòu)組成，在血漿中的含量最高[13]。在機(jī)體大量出血時(shí)，F(xiàn)IB最先消耗并最早達(dá)到凝血因子的臨界值，由此可見該指標(biāo)在探討藥物止血或者凝血作用的重要性。

SD大鼠具有穩(wěn)定性較好、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究止血或凝血藥物對(duì)凝血四項(xiàng)影響的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。謝珍等[14]對(duì)不同采血方式對(duì)SD大鼠的凝血四項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)影響進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示腹主動(dòng)脈采血得到的血樣的PT、APTT、TT及FIB指標(biāo)的穩(wěn)定性好，動(dòng)物之間數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。何佩恒等[15]研究不同取血方式對(duì)Wistar大鼠的血液學(xué)指標(biāo)的影響，從而得出腹主動(dòng)脈取血所獲取的血樣的各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，利用真空管和采血針對(duì)SD大鼠腹主動(dòng)脈取血速度快，且在采血過程中受到的干擾因素少，樣品的成分以及性質(zhì)較為穩(wěn)定，因此本研究中所檢測(cè)的血樣皆通過腹主動(dòng)脈取血獲得。除此之外，已有文獻(xiàn)研究EDTA-K2抗凝劑中的EDTA可以干擾或者抑制纖維蛋白凝塊形成時(shí)的纖維蛋白單體的聚合；草酸鈉抗凝劑可以與血中的Ca2+生成不溶性的草酸鈣沉淀，與這兩種抗凝劑相比，枸櫞酸鈉抗凝劑因其具有保護(hù)凝血因子等優(yōu)勢(shì)成為檢測(cè)凝血四項(xiàng)的理想抗凝劑。在本研究中，參照文獻(xiàn)中常用的抗凝濃度，利用3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑作為SD大鼠的抗凝劑。

綜上，在血液樣本的PT、APTT、FIB和TT的檢測(cè)過程中，血漿存放的時(shí)間、抗凝劑的種類、取血方式、血液質(zhì)量以及分析系統(tǒng)[16]等因素均會(huì)影響凝血四項(xiàng)的檢測(cè)值。因此，本實(shí)驗(yàn)室在固定樣本前處理方法的情況下，建立了本室的正常SD大鼠的凝血四項(xiàng)參考值范圍，其結(jié)果與文獻(xiàn)記錄一致[17-19]。該范圍的建立加強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)室檢查和管理的質(zhì)量控制，并為后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的順利開展提供了參考。