李高輝 呂文良 閆 暾 李娟梅 武慶娟 趙 婷

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院感染疾病科，北京 100053)(2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

肝纖維化是肝臟修復過程中出現的生理病理過程，但是長期致病因素刺激或相關細胞因子缺乏會引起纖維增生而降解相對或絕對不足而導致細胞外基質不斷沉積，最終發(fā)展成為肝硬化。因此，阻止肝纖維化的進展對慢性肝疾病的治療至關重要。Popper[1]曾強調指出誰能阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生，誰就能治愈大多數慢性肝病。隨著近年來學科交叉的不斷研究深入，肝纖維化過程可以被終止甚至得到逆轉[2]的結論不斷得到證實。

動物實驗能幫助人們了解疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸、預后及指導臨床治療。目前，實驗室誘導鼠類肝纖維化模型的主要方法[3-6]有四氯化碳法、硫代乙酰胺法、二甲基亞硝胺法和二乙基亞硝胺法、膽總管結扎法、D-半乳糖胺法、免疫法、乙醇法、營養(yǎng)法、血吸蟲法、慢性病毒感染法、復合法等。四氯化碳誘導的肝纖維化動物模型在形態(tài)學及病理生理學的某些方面與人肝纖維化相似，如兩者均有肝細胞壞死后的再生，實驗動物表現的體征及肝功能異常與人慢性肝病進展為肝硬化過程相似[7]。只是在實際的實驗過程中，因為缺乏統一的造模標準，造成了模型誘導過程中出現造模不及或太過導致肝硬化，動物過多死亡等問題，影響后續(xù)實驗的科學性。本文采取文獻數據分析的方法對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型進行分析和再評價。

1 方法

1.1 文獻搜集

計算機檢索數據庫“中國知網、萬方數據知識服務平臺、維普網”以“四氯化碳”“CCl4”“肝纖維化”“動物模型”為關鍵字進行文獻檢索，對文獻下方相關參考文獻也進行檢索，文獻發(fā)表時間為2015年1月1日—2020年12月31日。

1.2 文獻閱讀和數據摘錄

閱讀文獻了解實驗思路和造模過程，選取相關數據錄入Excel表格以備篩選。臨床上，肝組織穿刺活檢仍是診斷肝纖維化的標準方法[8]，因此，在評價造模是否成功時，參考2019年《肝纖維化診斷及治療共識》，以實驗中的肝臟病理切片為主要評價依據，動物最終的肝臟病理組織形成假小葉為重要參考。近年來, 無創(chuàng)傷性的血清學檢查方法得到普及，甚至有作者提出肝纖維化血清學檢測在特定的條件下可以代替肝組織活檢[9]。目前，診斷肝纖維化常用的生化指標有谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、Ⅲ型前膠原(PCIII)、透明質酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)等。參與肝纖維化的細胞外基質成分，包括膠原蛋白、蛋白多糖及黏連蛋白三大類，PC-Ⅲ、HA、LN分別是這三種細胞外基質成分的代表[10]。因此，摘錄文獻中有關肝纖維化血清學檢測空白對照組和模型組的指標數據。

1.3 排除標準

①排除沒有病理切片輔證的文獻。②排除四氯化碳與其他方法混合誘導肝臟損傷的文獻。③排除動物為非SPF級Wistar或SD大鼠的文獻。④排除造模后應用藥物干預前沒有相關檢測數據判斷其肝纖維化程度的文獻。⑤排除數據用線圖表示，不能進行數據挖掘分析的文獻。⑥排除綜述類文獻。

2 檢索文獻結果

中國知網共檢索到文獻180篇，萬方數據知識服務平臺數據庫檢索到99篇，維普網數據庫檢索到32篇。去除重復文獻，總文獻數為141篇。按照“排除標準”排除46篇。

3 數據摘錄與處理

文獻數據摘錄時發(fā)現，對肝纖維化判斷除病理結果之外，血清學指標差異較大，所以選取檢測率高的ALT和AST為血清學評價指標，最終納入評價范圍的文獻數量為60篇。應用Excel表格記錄文獻題目、動物品系、性別、藥物作用途徑、四氯化碳濃度及劑量、用藥頻率、動物死亡率、病理檢查結果及血清學ALT和AST檢驗結果。

對病理檢查結果依“Ishak”纖維化評分進行打分。分值為1打1分，分值為6打6分。血清血指標計算其“升高率”，對“升高率”進行劃檔打分，AST升高率：小于1時記2分，在1～2記3分，在2～4記4分，大于4記5分。ALT升高率：小于2記2分，在2～4記3分，在4～6記4分，大于6時記5分。各指標以其在模型評價中的決定程度分別×不同百分比：纖維化評分×40%，AST評分×30%，ALT評分×30%，三個結果之和為該文獻模型的最終評分。

4 統計分析

表1 四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型文獻統計表

5 結果

5.1 四氯化碳導致肝毒的機制

四氯化碳進入機體后，經肝臟細胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(—CCl3)和三氯甲基過氧自由基(—OOCCl3)， 后者可直接損傷質膜,啟動脂質過氧化作用，破壞肝細胞的膜性結構等，造成肝細胞變性壞死。國外從20世紀30年代開始使用四氯化碳誘導動物模型，以其操作簡便，經濟節(jié)約，周期較短等優(yōu)點至今仍作為經典的誘導方法，被科研人員采用。

5.2 動物品系

本文重點搜索Wistar大鼠和SD大鼠誘導模型的文獻。納入評價的文獻中采用Wistar大鼠作為模型動物數量為11篇，采用SD大鼠作為模型動物數量為49篇。對雄性Wistar和SD大鼠限定其藥物作用途徑為“皮下注射”和“腹腔注射”，當“皮下注射”時Wistar大鼠為(3.02±0.48)分，SD大鼠為(3.68±0.66)分(P<0.05)，具有統計學意義，平均造模時間為Wistar大鼠6.8周，SD大鼠8.5周。當“腹腔注射”時Wistar大鼠為(4.33±0.58)分，SD大鼠為(3.38±0.50)分(P<0.05)，具有統計學意義。平均造模時間為Wistar大鼠6.3周，SD大鼠6.9周，可見Wistar與SD對四氯化碳的敏感性并不相同，Wistar大鼠對于腹腔注射的反應性更加靈敏，而SD大鼠對皮下注射的反應性更好(圖1)。

圖1 不同品系大鼠對不同注射方式的纖維化評分比較

5.3 藥物作用途徑

納入的文獻中，誘導方式為腹腔注射的有19例，皮下注射的有32例，灌胃的有7例，灌腸的有1例，另有1例誘導方式不明。比較同類大鼠，對不同的作用途徑的差異，限定其性別為“雄性”，四氯化碳濃度為“50%”，選取品系為“SD”，比較“皮下注射”“腹腔注射”“灌胃”之間的差異性?！捌は伦⑸洹迸c“腹腔注射”以及“灌胃”兩兩比較的結果，均無統計學差異(P>0.05)。其中，“皮下注射”(3.70±0.70)分，造模周期10.5周；“腹腔注射”(3.50±0.50)分，平均周期8.3周；“灌胃”(3.56±0.56)分，造模周期8.8周(圖2)。

圖2 50%四氯化碳不同用藥方式對雄性SD大鼠的造模評分

對于使用高濃度的四氯化碳油劑進行模型誘導時，多采取低劑量、長周期的方式以提高模型誘導的成功率，但是這意味著實驗效率會受到一定影響。

5.4 四氯化碳濃度

文獻中使用的四氯化碳濃度有20%、40%、50%和60%，限定比較條件為雄性SD大鼠，皮下注射40%四氯化碳油劑，比較40%、50%和60%四氯化碳誘導模型的差異。40%與50%以及60%兩兩相比(P>0.05)，均無統計學差異(圖3)。其中，40%(3.71±0.61)分，平均周期8周，50%(3.70±0.92)分，平均周期10.5周，60% 4.00分，平均周期10周。相比40%與50%四氯化碳，二者打分相近，而40%的平均造模時間更短。雖然60%濃度的得分更高，但是相應的耗時也更長。

在實際操作中，當選擇不同物種進行肝纖維化模型誘導時，應當首先考慮到物種的差異，并且不能將某一方案死板的套用在不同動物上。當確定實驗動物后，然后確定藥物作用途徑。經過統計計算，各種作用途徑之間評分雖然沒有明顯的差異，但是在實驗平均用時方面可以看到不同途徑之間的差別。確定作用途徑后，選擇的四氯化碳濃度則可根據物種和作用途徑來決定，用量和周期之間具有相關性，用量越大，相應周期越短。

綜合以上數據，對造模周期進行分析，篩選出以下四種四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的實驗方案：當實驗對性別無要求時，推薦選擇雄性大鼠作為造模對象，當需要選擇不同的品系進行實驗，或者對用藥途徑有要求時可參考表2。

表2 四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的最佳實驗方案

6 討論

6.1 一般情況

在模型誘導期間，模型組均會表現出不同程度的毛色無光、飲食量減少、精神萎靡、行動遲緩、尿黃、大便變稀及體質量增長減慢，甚至出現腹水和急性死亡，所以應該嚴密注意大鼠的行為表現，結合我們在實際進行大鼠肝纖維化模型誘導中的經驗，當發(fā)現大鼠體質量短期內發(fā)生較大變化時，應該予以重視，可能出現急性肝損傷，導致大鼠食欲降低，造模后期同時應該考慮腹水的發(fā)生，應對方案為停止對大鼠的繼續(xù)藥物損傷，進一步觀察。皮下注射誘導模型時，應該采取輪流注射的方式并注意注射部位的無菌保護，否則容易出現皮毛脫落甚至皮膚潰爛的現象，尤其在夏、冬兩季進行實驗，更需要保證大鼠環(huán)境的無菌和干燥，將飼養(yǎng)環(huán)境溫度、相對濕度控制在合理范圍，避免實驗外部因素造成的大鼠死亡。

6.2 動物品系

不同動物對實驗因素的敏感性不同，因此，對品系的恰當選擇有利于實驗設計和結果輸出。用于誘導肝纖維化模型的品系有SD大鼠、Wistar 大鼠、C57[71]小鼠、昆明小鼠、ICR[72]小鼠等，而大鼠具有體型大易于操作和觀察，采血量多且敏感性高，性格溫順等優(yōu)點被大多數實驗者接受并采用。

6.3 性別因素

目前，研究者多采取雄性大鼠進行模型誘導實驗。劉清華等[73]采用皮下注射40%四氯化碳誘導肝纖維化模型，并觀察在完整雌性小鼠與切除卵巢的去勢小鼠皮下注射0.002% β-Est(17β-雌二醇)產生的影響，檢測得到去勢+四氯化碳組各項生化指標數據遠高于去勢組+四氯化碳+雌激素組和對照組；許君望等[74]通過皮下注射400 mL/L 四氯化碳誘導大鼠肝纖維化動物模型，觀察雌激素(苯甲酸雌二醇)對大鼠α大平滑肌肌動蛋白表達和對肝臟膠原含量的影響，實驗組大鼠肝臟α滑肌肌動表達明顯高于對照組和四氯化碳+雌激素組，同時肝組織出炎癥、壞死、膠原沉積及假小葉形成，說明雌激素對肝纖維化過程有延緩作用。流行病學數據也顯示肝硬化及其并發(fā)癥在男性中的發(fā)病率高于女性，其發(fā)病率之比為2.3∶1～2.6∶1[75]。因此，造模過程中應避免雌激素對實驗結果的影響而采用雄性實驗動物。

6.4 用藥途徑

目前，采取的四氯化碳用藥途徑主要有腹腔注射、皮下注射、灌胃及四氯化碳吸入[76-77]。四氯化碳是一種選擇性肝毒性物質，能直接損害肝細胞，破壞細胞的各種成份[78]。國內采用四氯化碳吸入造模的報道較少，有國外學者采用此法，10周后僅形成脂肪變性及極少量的肝細胞壞死,且個體差異較大。腹腔注射是采用將四氯化碳油劑直接注射到胃腸到漿膜層以外，經腹膜直接吸收進入門靜效率高，皮下注射通常采用的部位是背部皮下和后腿內側皮膚，皮下注射通過微血管吸收，相比腹腔注射吸收速率慢，因此在注射相同濃度的四氯化碳油劑時，腹腔注射組死亡率更高,但周期更短。灌胃是使用灌胃器直接將四氯化碳灌注到胃里，藥液經過門靜脈系統吸收，直接進入肝臟，葉霖財等[72]通過實驗發(fā)現灌胃和腹腔注射的方式均能獲得理想的實驗結果，其中灌胃死亡率小于10%，而腹腔注射死亡率大于80%，說明灌胃動物耐受性更好；藥物注射是實驗過程的中心環(huán)節(jié)，有資料[79]顯示腹腔注射的小鼠會出現腹膜、腸壁和腹腔臟器粘連現象，以及因為刺破膀胱，腸道引發(fā)感染導致死亡，皮下注射出現皮膚潰爛引發(fā)感染，灌胃時因誤入氣管而導致老鼠死亡，實驗中的人為操作因素對實驗結果影響較大，這對實驗者的操作熟練程度也提出了一定要求。

6.5 四氯化碳用量

大鼠的用藥濃度為20%～60%，單次用量0.1～0.3 mL/100 g，頻率多為2次/周，造模周期為4～12周。鄭君等[80]指出四氯化碳進入體內15 min即可引起肝損傷，48 h達到高峰，隨后肝臟進入修復階段。史智勇等[81]提出采用低劑量、間歇皮下注射的方法以提高動物生存率。張海燕等[82]在比較實驗中發(fā)現當50%四氯化碳劑量超過2.5 mL/kg時，動物死亡率會升高。我們提出的方案中，考慮到品系的差異性和對不同注射方式的敏感程度，推薦根據研究目的選擇實驗動物，根據實驗操作的熟練程度選擇注射方式和用量。

6.6 實驗操作

根據以往造模經驗，我們總結出四氯化碳誘導肝纖維化的注意事項并建議：①較長的造模周期，大鼠體型不斷增大，使大鼠的抓取注射難度增加，我們推薦使用氣體麻醉機，這有助于減輕因大鼠掙扎導致的針尖對其臟器的損傷，減輕大鼠痛苦，符合動物倫理學要求。②為了注射計量的準確，通常采用1 mL注射器，但1 mL注射器針頭太細易造成油劑阻塞，因此建議采用4.5-5號針頭，為了避免交叉感染，應一鼠一針，或者針頭用75%乙醇消毒后再用。③采取腹腔注射時，當針頭刺入腸道時，回抽會見到黃色渾濁液體進入針管，而造模后期可能出現肝硬化腹水的情況，因此在注射器回抽時見到黃色液體時，應退出注射器，換另一側注射，若仍然抽出液體，排除因操作不當刺入腸道外，應考慮大鼠肝硬化腹水的發(fā)生。④為了避免刺傷腸道，還可以將大鼠皮毛提起，沿提起的皮下與肌肉成30度角進針，感覺落空感，回抽為負壓后，再進行注射。⑤皮下注射時，應該采取輪流更換位置的方法，避免對同一區(qū)域的重復針刺，并且保證一定的針刺深度，否則四氯化碳油劑容易漏出，影響造模效果。注射完成后可用手按壓皮下包塊，幫助皮下快速吸收。

6.7 存在問題

在文獻的閱讀過程中發(fā)現，不乏有研究者實驗步驟描述不清、使用動物與參考造模文獻有差異、診斷肝纖維化描述模糊等問題，均影響到文獻的可信度。

理想的肝纖維化病理模型應具有以下優(yōu)點：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似。②病變有一定發(fā)展過程，病程發(fā)展存在一個可逆與不可逆的階段性演進過程。③形成率高、病死率低和重復性好。④方法簡便易行。⑤動物易獲得，經濟實用。四氯化碳誘導的動物模型在形態(tài)學和病理生理學方面與人類肝纖維化多有相似，有自然恢復的特點。合理規(guī)范的運用四氯化碳誘導肝纖維化對科學研究無比重要，希望我們的工作可以為此提供有價值的參考。