孫夢雪，何曉璞，黃佩云，劉高雙，吳勝男，孫為豪

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科，南京210029)

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一。目前胃癌的主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療，但是預(yù)后均較差[1]。因此，繼續(xù)尋找有效的天然抗腫瘤藥物并探究其作用機(jī)制具有重要意義。乳香是乳香樹或同屬植物樹皮滲出樹脂的活性成分?，F(xiàn)已證實(shí)，乳香中分離純化的乳香酸在肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和惡性膠質(zhì)瘤等腫瘤中具有抗癌功效[2]。胃癌被認(rèn)為是與幽門螺旋桿菌感染相關(guān)的炎癥性疾病，之前研究表明，乳香可以通過其抗炎機(jī)制抑制幽門螺旋桿菌感染，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而阻止胃癌的進(jìn)展[3]。

環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)是腫瘤預(yù)防和治療的靶點(diǎn)。COX-2參與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)過程，如血管生成、侵襲和免疫逃避等[4]。COX-2受多種因素和信號(hào)通路的調(diào)控，在所有的上游調(diào)控因子中，PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB, 亦稱Akt) 通路的激活對(duì)COX-2的調(diào)控非常重要[5-7]。同源性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸化酶功能的抑癌基因, 在許多腫瘤組織中都存在PTEN缺乏[8]。PTEN拮抗Akt信號(hào)通路，當(dāng)PTEN基因突變或丟失時(shí)，Akt信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖形成腫瘤。

本研究以COX-2高表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株SGC7901為研究對(duì)象，旨在確定乳香是否能通過PTEN/Akt途徑下調(diào)胃癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)，從而阻止胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

胃癌細(xì)胞SGC7901(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，上海)； 乳香(南京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京)，配制過程詳見文獻(xiàn)[9]描述；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素[以色列Biological Industries(BioInd)公司，以色列]；二甲基亞砜、 噻唑蘭(MTT)、 凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)； PTEN、 p-Akt、 Akt、 COX-2、 GAPDH抗體(Abcam公司，英國)；裸鼠(南京青龍山動(dòng)物場，南京)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraus公司，德國)；流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國)；蛋白免疫印跡系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國)。

1.2 建立人胃癌裸鼠移植瘤模型

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均符合南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)制定的規(guī)程。

12只無胸腺裸鼠：雄性，5周齡，體質(zhì)量18～22 g，無特定病原體級(jí)。在(24±2)℃、濕度60%～80%和照明12 h光/暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，提供標(biāo)準(zhǔn)的裸鼠飼料及蒸餾水，7 d后開始實(shí)驗(yàn)。調(diào)整SGC7901細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，每只裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.2 ml。在胃癌細(xì)胞植入7 d后(腫瘤體積達(dá)到0.1 cm × 0.1 cm×0.1 cm)，將所有裸鼠隨機(jī)分成2組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組裸鼠灌胃乳香80 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃14 d。對(duì)照組裸鼠每日用等體積的生理鹽水灌胃。每隔2 d記錄裸鼠的體質(zhì)量，測量腫瘤體積(0.5×最短直徑2×最長直徑)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞傳代

復(fù)蘇胃癌SGC7901細(xì)胞后，用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長融合至 70%～80%時(shí)，用胰酶消化及傳代， 接種于新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT檢測乳香對(duì)細(xì)胞增殖的影響

調(diào)整SGC7901細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100 μl。不同濃度的乳香0.0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/ml分別處理細(xì)胞12、24和48 h，以只含培養(yǎng)基無細(xì)胞為空白對(duì)照組。檢測時(shí)每個(gè)孔中加入200 μl MTT(0.5 mg/ml)，4 h后加入200 μl二甲基亞砜避光15～20 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處各孔的吸光度值(A570nm)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml。用不同濃度的乳香(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/ml)處理細(xì)胞24 h。用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化后收集細(xì)胞，預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗細(xì)胞2次，1 ml的結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸，加入10 μl的Annexin V 異硫氰酸熒光素和10 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光孵育20 min，1 h內(nèi)完成檢測。

1.6 Western blotting檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

用不同濃度的乳香(0.0、2.0、4.0 mg/ml)處理SGC7901細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。加入裂解液冰上裂解30 min。4℃，14 000 轉(zhuǎn)/min離心30 min后收上清液。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜。抗體：PTEN(1∶10000)，p-Akt(1∶1000)，Akt(1∶1000)，COX-2(1∶2000)和GAPDH(1∶10000)。4℃二抗孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

在6孔板底外用記號(hào)筆畫3條間隔為0.5 cm的水平直線，將濃度為 4×105/ml的細(xì)胞懸液接種于 6孔板中，每孔2 ml，常規(guī)培養(yǎng)至 90%融合狀態(tài)。用 10 μl微量移液器槍尖在細(xì)胞板上劃垂直于水平線的劃痕。PBS清洗 2 次后，在每個(gè)孔中加入濃度為0.0、2.0、4.0 mg/ml的乳香培養(yǎng)48 h。于劃痕后0、24、48 h用顯微鏡(原始放大倍數(shù)100倍)拍攝相同部位的圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乳香對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測乳香對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果詳見圖1。乳香以劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖(P<0.05)。

2.2 乳香對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

統(tǒng)計(jì)Q3象限(Annexin V+/PI-)的早期凋亡細(xì)胞和Q2象限(Annexin V+/PI+)的晚期凋亡細(xì)胞。分析發(fā)現(xiàn)，乳香能以劑量依賴性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡(圖2)。

圖1 乳香對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of frankincense on proliferation of SGC7901 cellsCompared with 0.0 mg/ml, *P <0.01; compared with 12 h, #P <0.01.

2.3 乳香對(duì)胃癌細(xì)胞中PTEN、p-Akt和COX-2蛋白表達(dá)的影響

不同濃度的乳香(0.0、2.0、4.0 mg/ml)干預(yù)細(xì)胞24 h后，PTEN表達(dá)上調(diào)，p-Akt和COX-2表達(dá)下調(diào)，且呈劑量依賴性(圖3)。

2.4 乳香對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

乳香以劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的遷移(P<0.05；圖4)。

圖2 乳香對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Frankincense induces apoptosis of SGC7901 cellsA：flow cytometry-based annexin V-FITC/PI labeling of apoptotic cells；B：statistical analysis. Compared with 0.0 mg/ml, *P<0.01. FITC: fluorescein isothiocyanate isomer; PI: propidium iodide.

圖3 乳香對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞中PTEN、COX-2 and p-Akt蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of frankincense on expression levels of PTEN, COX-2 and p-Akt in SGC7901 cellsA：Western blotting；B：statistical analysis.PTEN: phosphatase and tensin homolgy deleted on chromosome ten; COX-2: cyclooxygenase-2; Akt: protein kinase B; p-Akt: phosphatased Akt. Compared with 0.0 mg/ml, *P<0.01.

圖4 乳香對(duì)SGC 7901細(xì)胞遷移的影響Figure 4 Effect of frankincense on migration of SGC7901 cellsA：phase micrographs of SGC7901 cells at various times after monolayer wounding (×100)；B：quantification analysis of cell migration Compared with 0.0 mg/ml, *P <0.01; compared with 24 h, #P<0.01.

2.5 乳香對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長的影響

實(shí)驗(yàn)組裸鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組(P<0.05；圖5A)。乳香灌胃6 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖5B)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的裸鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖5C)。本實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)裸鼠的死亡。研究結(jié)果顯示，乳香能夠抑制胃癌移植瘤的生長。

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳香能夠通過下調(diào)胃癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖，這可能與PTEN/Akt信號(hào)通路有關(guān)。COX-2是一種前列腺素過氧化物合成酶，在炎癥細(xì)胞和多種腫瘤組織中呈過表達(dá)[10]。COX-2過表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，抑制COX-2的表達(dá)能有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[11]。Akt通路能夠調(diào)控COX-2的表達(dá)，它是重要的細(xì)胞凋亡通路，對(duì)癌癥細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要的調(diào)控作用[12,13]。PTEN可負(fù)性調(diào)節(jié)Akt通路。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳香能夠通過下調(diào)人胃癌SGC7901細(xì)胞中的COX-2的表達(dá)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究在體外檢測了PTEN/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，Western blotting結(jié)果顯示乳香能上調(diào)PTEN的表達(dá)，下調(diào)p-Akt和COX-2的表達(dá)。

在體外實(shí)驗(yàn)中，本研究采用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測了乳香對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901的增殖能力和遷移能力的抑制作用。結(jié)果表明：隨著給藥劑量增加及藥物作用時(shí)間的延長，乳香對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖和遷移的抑制作用逐漸增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)觀察到乳香作用于SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率均升高，且呈劑量依賴性，與MTT結(jié)果一致。既往研究已經(jīng)證實(shí)，乳香能夠抑制裸鼠體內(nèi)乳腺癌[14]、前列腺癌[15]、肝癌[2]、惡性膠質(zhì)瘤[16]等腫瘤的生長。為了檢測乳香在體內(nèi)的抗胃癌作用，本研究建立了人胃癌細(xì)胞SGC7901移植瘤裸鼠模型，與之前的研究[2，14-16]結(jié)果一致，本研究結(jié)果同樣證明了乳香在裸鼠體內(nèi)對(duì)胃癌具有抗腫瘤作用。乳香灌胃處理的裸鼠與對(duì)照裸鼠相比，腫瘤明顯較小。乳香能抑制腫瘤的生長，且不會(huì)引起裸鼠體質(zhì)量明顯減輕、精神狀態(tài)及活動(dòng)度變差等。若要將研究結(jié)果推及到人體，我們?nèi)孕鑼?duì)乳香進(jìn)行進(jìn)一步的安全性分析與劑量研究。

圖5 乳香抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤生長Figure 5 Frankincense inhibits gastric tumor growth in vivoA：gastric cancer xenograft tumor growth in vivo；B：tumor volume change；C：body mass change. Compared with control group, *P<0.01

綜上，由于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，乳香抑制胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)也可能受其他通路調(diào)控，不同信號(hào)通路之間也會(huì)相互影響，要想全面了解調(diào)控COX-2表達(dá)的作用機(jī)制還需要更深入的研究。