彭怡倩 高晶 陳藝升 陸子贇 應春妹

微生物（大多為細菌，極少數(shù)為真菌、原蟲、病毒）在泌尿系統(tǒng)中繁殖而引起的泌尿系統(tǒng)炎癥稱泌尿系統(tǒng)感染，其發(fā)病率位居臨床感染性疾病的第二位。尿路感染主要引起患者排尿困難和腰腿酸痛，如不能及時進行治療將加重病情，甚至可以引起急、慢性腎功能不全和敗血癥等［1］。婦科患者受特殊解剖結(jié)構(gòu)、手術(shù)部位、治療后創(chuàng)傷、留置導管等一系列因素影響，更容易引起醫(yī)院感染，尤其容易發(fā)生尿路感染［2］。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌耐藥性高于非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，不同類型的耐藥基因型菌株耐藥性也有所不同，本研究標本皆來自婦科疾病尿路感染患者清潔中段尿，對培養(yǎng)分離的病原菌流行病學特征和耐藥基因分型進行分析，為婦科疾病尿路感染患者臨床合理使用抗菌藥物預防和治療以及院內(nèi)感染的管理控制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至12月本院婦科住院臨床診斷為尿路感染患者（即有尿頻、尿急、尿痛等癥狀，尿離心沉渣鏡檢白細胞計數(shù)大于10/HP）清潔中段尿883份，定量接種后培養(yǎng)檢出病原菌且計數(shù)結(jié)果＞105CFU/ml 321株。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，來源于上海市臨檢中心。

1.2 試劑與儀器 （1）試劑：哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和念珠菌顯色培養(yǎng)基均是法國生物梅里埃公司生產(chǎn)；使用法國生物梅里埃VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀對菌株進行鑒定及藥敏試驗；真菌藥敏試驗使用法國生物梅里埃ATB-Fungus3手工藥敏板條；藥敏結(jié)果折點判定參考美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）M100-S27；PCR試劑GoTaq?DNA聚合酶和配套緩沖液5×GoTaq?Reaction Buffer購自Promega公司；細菌基因組提取試劑盒購自上海天根生化科技有限公司；DL2000 DNA marker、dNTP購自大連TaKaRa公司；50×TAE電泳緩沖液購自上海生工生物有限公司；10mg/ml溴化乙錠（EB）溶液購自Sigma公司。（2）儀器：PCR擴增儀cobasZ480（Roche公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀3500（上海天能科技有限公司）；紫外線投射凝膠成像系統(tǒng)GelDoc2000（美國Bio-rad公司）；微型加熱器（美國BD公司）；臺式超速離心機5804R（德國eppendorf公司）；電熱恒溫水浴鍋DK-S22型（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 培養(yǎng)方法 培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第4版）》［3］進行標本的留取和接種培養(yǎng)，采用10μl定量接種環(huán)取尿液標本，接種于哥倫比亞血瓊脂平板及麥康凱瓊脂平板，置于35℃，5%CO2培養(yǎng)18～24h，菌落計數(shù)≥105CFU/ml所分離得到的菌落進行鑒定、藥敏試驗表型分析及ESBLs基因型分析。

1.4 表型分析 根據(jù)CLSI M100-S29將產(chǎn)ESBLs的可疑菌株使用K-B法對頭孢他啶/棒酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/棒酸進行擴散試驗后，分別測量其抑菌圈直徑，若該種藥物的合劑抑菌圈的直徑減去單劑抑菌圈的直徑之差≥5mm即可判定為ESBLs陽性［4］。

1.5 ESBLs基因型分析 PCR擴增引物首先提取待檢樣本，采用25μl PCR反應體系，對產(chǎn)ESBLs的菌株耐藥基因進行擴增分析。反應條件為：94℃5min預變性；94℃ 30s變性和55℃分別為45s退火，72℃ 1min延伸，30個循環(huán)后，再進行72℃ 5min最后延伸。用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，擴增產(chǎn)物由華大測序，測序結(jié)果進行在線比對（http://pubmlst.org/adatbases/）后，確定菌株基因型別，引物信息見表1。

表1 基因引物相關(guān)信息

1.6 統(tǒng)計學方法 應用WHONET5.6軟件對細菌分布及耐藥性情況進行分析，組間資料比較采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 婦科疾病尿路感染患者流行病學特征分析 883份清潔中段尿液標本檢出病原菌321株，已剔除同一患者的相同菌株，陽性檢出率36.4%。其中革蘭陰性桿菌265株，占82.6%，以大腸埃希菌為主68.2%（219/321），其次為肺炎克雷伯菌4.7%（15/321）；陽性球菌50株，占15.6%，以糞腸球菌為主12.2%（39/321）；真菌6株，占1.8%，以白念珠菌為主。

2.2 細菌藥敏試驗結(jié)果分析 （1）革蘭陰性桿菌：本院尿路感染患者中段尿培養(yǎng)檢出數(shù)量最多的大腸埃希菌，對氨芐西林的耐藥率為93.2%，對頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率為0.9%，喹諾酮類抗菌藥物耐藥率為49.8%～53.0%，未檢出碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株，對阿米卡星耐藥率為4.1%，對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復合制劑如哌拉西林/他唑巴坦耐藥率為1.4%，對氨芐西林/舒巴坦耐藥率為50.7%。（2）革蘭陽性球菌：本院尿路感染患者中段尿培養(yǎng)檢出的革蘭陽性球菌，未檢出對萬古霉素、利奈唑胺耐藥的菌株，對青霉素、氨芐西林及喹諾酮類抗菌藥物耐藥率高于90%，對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率為5%。（3）真菌：檢出的真菌主要以白念珠菌和光滑念珠菌為臨床常見真菌，對5-氟胞嘧啶和兩性霉素耐藥率為0%。白念珠菌對伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑耐藥率分別為50.0%、33.3%、33.3%。（4）產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率：在219株大腸埃希菌臨床標本中產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌檢出率為70.3%（154/219），對氨芐西林的耐藥率為100%，喹諾酮類抗菌藥物耐藥率為54.5%～57.8%，未檢出碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株，對阿米卡星耐藥率為3.9%，對β-ESBLs抑制劑的復合制劑如哌拉西林/他唑巴坦耐藥率為0%，對氨芐西林/舒巴坦耐藥率為50.7%。產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性的比較結(jié)果顯示，對常見抗生素耐藥率有顯著差異。見表2。（5）產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因型分析：本研究對154株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因型進行研究，對主要的三種基因型CTX、TEM和OXA進行檢出，基因凝膠電泳部分檢測結(jié)果見圖1～3，檢出率分別是66.7%、55.0%和13.3%，同時分別對攜帶三種不同耐藥基因的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進行耐藥性分析。攜帶三種不同耐藥基因的大腸埃希菌對哌拉西林/他唑巴坦、碳青霉烯類藥物（亞胺培南和美羅培南）、4代頭孢菌素（頭孢吡肟）和頭孢他啶均敏感，對氨芐西林、頭孢唑啉和頭孢曲松全耐藥。氨基糖苷類中慶大霉素和磺胺類的復方新諾明的耐藥率較高，呋喃妥因耐藥率較低，見表3。（6）攜帶不同耐藥基因的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在不同病房分布的流行病學分析：按樓層將婦科病房進行分組，對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌攜帶的三種不同耐藥基因檢出率進行χ2檢驗，攜帶CTX基因和OXA基因的菌株在不同病房的分布有顯著差異（P＜0.05），在不同樓層的病房有水平傳播并爆發(fā)流行的風險；攜帶TEM基因的菌株在各病房的分布結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），未顯示有水平傳播并爆發(fā)流行的風險。

表2 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥情況比較

圖1 CTX型基因凝膠電泳部分檢測結(jié)果

圖2 TEM型基因凝膠電泳部分檢測結(jié)果

圖3 OXA型基因凝膠電泳部分檢測結(jié)果

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌各基因型耐藥率

3 討論

本藥敏試驗結(jié)果顯示，321株菌株中未檢出耐萬古霉素腸球菌，與我國的耐藥監(jiān)測流行病學數(shù)據(jù)一致；檢出的真菌主要以白念珠菌和光滑念珠菌為臨床常見真菌，未檢出對5-氟胞嘧啶和兩性霉素耐藥的菌株。陰性桿菌以大腸埃希菌為主要致病菌，219株大腸埃希菌對碳青霉烯類亞胺培南、厄他培南均敏感。亞胺培南具有廣泛的活性和穩(wěn)定的β-內(nèi)酰胺酶，這些特性使亞胺培南成為治療腸桿菌科、厭氧菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌嚴重感染的重要治療手段。但碳青霉烯類抗菌藥物抗菌譜較廣，容易導致二重感染，臨床一般選擇此類藥物時會比較謹慎。碳青霉烯類藥物耐藥性的產(chǎn)生機制非常復雜，主要是通過產(chǎn)生碳青霉烯酶，但也可能是由于外膜孔蛋白功能障礙，再加上Ampc頭孢菌素酶或ESBLs的過度產(chǎn)生所致。本研究檢出的菌株對頭霉素類頭孢替坦、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶哌拉西林/他唑巴坦、氨基糖苷類阿米卡星和呋喃妥因的耐藥率也較低。哌拉西林/他唑巴坦耐藥率低可能與其使用需要皮試以及有腎毒性相關(guān)，臨床較少用于尿路感染。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌樣本與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的樣本比較，對抗菌藥物的耐藥性普遍更高，尿液是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的主要標本來源。ESBLs能夠?qū)︻^孢菌素類藥物、青霉素類藥物及單環(huán)類藥物進行水解，對哌拉西林、頭孢噻肟和氨芐西林3種藥物幾乎無效，耐藥率高達100%，是目前臨床上革蘭陰性菌中的主要耐藥菌。除了頭霉素類頭孢替坦、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶哌拉西林/他唑巴坦、氨基糖苷類阿米卡星和頭孢三代霉素頭孢他啶對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌更敏感。根據(jù)美國CLSI 規(guī)定，一旦患者被檢出感染產(chǎn)EBSLs大腸埃希菌，則應立即停止使用青霉素類、頭孢類、單環(huán)類抗菌藥物，另選其他治療方案［4］。既往研究認為，前期碳青霉烯類、含酶抑制劑的復合制劑類或氟喹諾酮類等抗菌藥物使用是引起碳青霉烯類耐藥腸桿菌或非發(fā)酵菌定植或感染的主要危險因素［5］。將產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對16種抗菌藥物進行χ2檢驗，四代頭孢、呋喃妥因和氨基糖苷類藥物耐藥率無顯著差異（P＞0.05）外，其他抗菌藥物耐藥率均有顯著差異（P＜0.05），因此根據(jù)細菌種類不同合理選用抗菌藥物十分有必要。

ESBLs由于基因同源性差異分為5類：CTX型、TEM型、SHV型、OXA型和其它型（如土耳其的PER型、越南和泰國VEB型、巴西的BES型等）。國內(nèi)外研究顯示，不同類型的ESBLs分布具有明顯的地域差異。由于不同國家和地區(qū)使用抗菌藥物的種類和數(shù)量不同，ESBLs 流行的類型也不同，如意大利以SHV型、CTX-M型為主，加拿大以SHV型多見，亞洲其他國家也多以CTX型和TEM型為主［6-7］，而國內(nèi)主要以CTX和TEM型為主，部分地區(qū)也有OXA型，不過數(shù)量較少［8-9］，故本文主要檢測了CTX型、TEM型和OXA型三種耐藥型基因。本研究結(jié)果以CTX型為主，TEM型次之。本文將婦科病房按不同樓層分成7組對三種基因型進行χ2檢驗比對，其中攜帶CTX基因和OXA基因的菌株在不同樓層病房分布有顯著差異，有水平傳播和暴發(fā)流行的趨勢。攜帶三種耐藥基因的不同菌株的耐藥性也有差異，其中CTX型對青霉素類、頭孢菌素類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑、氨基糖苷類和氟喹諾酮類耐藥；TEM型能水解青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、β內(nèi)酰胺酶類/酶抑制劑復方劑，主要引起對β內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥；OXA型對青霉素類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗菌藥物有較高的耐藥性。本文所檢出的三種基因型對哌拉西林/他唑巴坦、碳青霉烯類藥物、三代和四代頭孢菌素均敏感。應根據(jù)菌株不同的類型和藥敏結(jié)果提示臨床合理使用抗菌藥物，同時嚴格管控防止院內(nèi)感染的發(fā)生。

隨著抗菌藥物在婦科感染領(lǐng)域的廣泛使用，多重耐藥菌檢出率的提高引起廣大臨床醫(yī)務工作者的高度重視。對于婦科尿路感染患者的病原菌耐藥性研究和相關(guān)菌株耐藥基因分型的研究，可以更有針對性為臨床合理使用抗菌藥物及院內(nèi)感染的管理控制提供參考依據(jù)。