張軍 朱海勇

膿毒癥（sepsis）是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），其發(fā)病機制復雜：包括病原微生物對組織器官的直接損傷和機體免疫功能紊亂等［1］，膿毒癥導致各種炎性因子和炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-6、C反應(yīng)蛋白（CRP）等大量釋放和活化，從而引起促炎因子和抗炎因子的平衡失調(diào)，機體免疫功能受到損傷。為了進一步深入研究膿毒癥的發(fā)病機制和診斷、預(yù)后的新方法，越來越多的科學家開始將基因調(diào)控技術(shù)應(yīng)用于膿毒癥的研究，尋找膿毒癥分子生物學靶標逐漸成為研究熱點。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼小RNA分子，在同源及不同源物種中具有高度一致性［2］。越來越多的研究顯示miRNA的表達與膿毒癥密切相關(guān)，不同miRNA在膿毒癥中表達也不同［3］。其中miRNA-451已被證實與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。本研究通過盲腸結(jié)扎穿刺方法建立膿毒癥大鼠模型，探究膿毒癥大鼠血清中miR-451的表達情況及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit（日本 Takara公司）；miR-451模擬物、抑制劑和對照劑（廣州銳博生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6和CRP酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海信然生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法 （1）盲腸結(jié)扎穿刺膿毒癥大鼠模型建立及分組：清潔級SD大鼠45只，200～250g，購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2013-0018。將大鼠隨機分成3組，分別為正常對照組、假手術(shù)組、膿毒癥組。其中正常對照組5只：正常飼養(yǎng)，不做任何處理；假手術(shù)組20只：大鼠麻醉后開腹，不做模型誘導處理；膿毒癥組20只：大鼠麻醉后開腹，行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)建立膿毒癥大鼠模型。其中假手術(shù)組和膿毒癥組按術(shù)后3h、6h、12h、24h分為四個小組，每組各5只。采用文獻提供的方法制備膿毒癥大鼠模型［5］，假手術(shù)組在剖腹后暴露并翻動盲腸，但不進行結(jié)扎和穿刺。給予術(shù)后大鼠皮下注射生理鹽水以進行液體復蘇。（2）大鼠血清中炎癥因子和miR-451表達量檢測：將各組大鼠麻醉后仰臥于固定臺，開腹后用注射器取下腔靜脈血8～10ml，分別置于2ml微量離心管，并將其于室溫下放置1h后離心收集上清液，置于-80℃冰箱保存待測。TNF-α、IL-6和CRP三個指標用商品化酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測，實驗嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用qRTPCR檢測miR-451在大鼠血清中的表達量情況。取出備用血清，按1：1加入1ml Trizol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Ki試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。以U6作為內(nèi)參基因。擴增后獲取各組Ct值，采用2-△△ct法計算相對表達量。miR-451上游引物序列：5"-CCGAAACCGTTACCATTAC-3"，下游引物序列：5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"。U6上游引物序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。（3）膿毒癥大鼠的miR-451外源性干預(yù)：清潔級SD大鼠20只，隨機分成模型組、miR-451mimic組、miR-451 inhibitor組、miR-451 NC，每組各5只。術(shù)后采用尾靜脈注射法立即向模型組、miR-451mimic組、miR-451 inhibitor組、miR-451 NC組大鼠分別注射生理鹽水、miR-451模擬物、miR-451抑制劑、miR-451對照劑各10μl（0.02nmol/μl）。繼續(xù)正常飼養(yǎng)24h后進行相關(guān)指標測定。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中炎癥因子的表達變化 如表1所示，正常對照組大鼠血清中TNF-α的表達量為（29.9±3.8）pg/ml，IL-6的表達量為（48.6±12.6）pg/ml，CRP的表達量為（1.5±0.2）pg/ml。假手術(shù)組和膿毒癥組中三種炎癥因子表達量均高于正常水平，并且在24h內(nèi)，隨著時間的增加表達量逐漸升高。同時，與假手術(shù)組同時間點相比較，膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP的表達量顯著增高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠中炎癥因子表達水平變化（）

表1 各組大鼠中炎癥因子表達水平變化（）

注：與假手術(shù)同時間比較，*P＜0.05

組別 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） CRP（pg/ml）假手術(shù)組 3h 46.8±11.3 52.3±9.6 1.9±0.3 6h 92.3±21.4 88.6±12.4 2.4±0.4 12h 185.6±36.4 256.1±16.9 3.4±0.6 24h 225.3±41.2 269.6±23.4 3.7±0.4膿毒癥組 3h 76.2±13.6* 88.6±12.4* 3.5±0.4*6h 173.9±26.3* 298.7±32.6* 8.5±0.6*12h 426.6±42.4* 523.6±48.6* 10.4±0.8*24h 448.4±52.4* 575.3±55.4* 10.3±1.2*正常對照組 29.9±3.8 48.6±12.6 1.5±0.2

2.2 大鼠血清中miR-451的表達變化 采用qRTPCR檢測造模前后大鼠血清中miR-451的表達量情況，結(jié)果如圖1所示，miR-451在正常對照組大鼠中維持在一個相對較高的水平。miR-451在假手術(shù)組大鼠中表達較正常對照組大鼠略微降低，隨術(shù)后時間變化不明顯。膿毒癥大鼠血清中，miR-451在術(shù)后3h表達明顯下調(diào)，并在24h內(nèi)隨時間的推移持續(xù)下降，變化幅度逐漸減緩。與假手術(shù)組同時間點相比較，膿毒癥大鼠血清中miR-451表達顯著降低（P＜0.05）。

圖1 大鼠血清中miR-451的表達情況（與假手術(shù)組比較，?P＜0.05）

2.3 大鼠經(jīng)過miR-451外源性干預(yù)之后血清中miR-451的表達變化 對膿毒癥大鼠進行miR-451外源性干預(yù)后，采用qRT-PCR檢測血清中miR-451表達情況，結(jié)果如圖2，miR-451 NC組大鼠中miR-451表達與模型組無顯著差異。而相對于miR-451 NC組大鼠，miR-451 inhibitor組大鼠中miR-451表達顯著降低（P＜0.05），miR-451mimic組大鼠中miR-451的表達顯著升高（P＜0.01），表明膿毒癥大鼠的miR-451外源性干預(yù)成功。

圖2 各組大鼠血清中miR-451的表達情況（與miR-451 NC組比較，?P＜0.05，??P＜0.01）

2.4 大鼠經(jīng)過miR-451外源性干預(yù)之后血清中TNF-α、IL-6和CRP的表達變化 大鼠經(jīng)過miR-451外源性干預(yù)之后檢測血清中TNF-α、IL-6和CRP的表達變化，結(jié)果如表2所示，相對于miR-451 NC組，miR-451 inhibitor組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表達量顯著升高（P＜0.05），而miR-451 mimic組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表達量顯著降低（P＜0.05），結(jié)果表明miR-451能夠有效降低膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)。

表2 各組膿毒癥大鼠中炎癥因子表達水平變化（）

表2 各組膿毒癥大鼠中炎癥因子表達水平變化（）

注：與miR-451 NC組比較，*P＜0.05

分組 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） CRP（μg/ml）模型組 423.2±32.3 437.8±33.6 9.3±1.4 miR-451 NC組 411.6±36.6 402.8±36.9 8.9±0.9 miR-451 inhibitor組 601.3±52.3* 598.6±52.6* 16.5±1.5*miR-451 mimic 組 298.6±22.3* 233.4±25.6* 4.2±0.8*

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，C反應(yīng)蛋白、趨化因子、細胞因子等與其他炎癥相重合的分子標記均無特異性［6］，因此，尋找理想的膿毒癥分子標記物是目前的重點。miRNA能夠調(diào)控人類＞30%的基因表達［7］，多項研究表明，miRNA參與炎癥、免疫及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達與膿毒癥密切相關(guān)，參與膿毒癥的免疫調(diào)控，miRNA可通過影響炎癥因子和炎癥因子信號通路來調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)。有研究報道［9］，膿毒癥患者中miR-18、miR-486表達上調(diào)，miR-146b、miR-150、miR-342表達下調(diào)，在臨床診斷中血液樣本采集較方便，應(yīng)用廣泛，目前病理狀態(tài)下miRNA作為疾病生物標志物的研究已成熱點。孟建斌等［10］通過大鼠miRNA-146a外源性干預(yù)，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a能夠通過靶向COX-2有效降低膿毒癥引起的炎性反應(yīng)。miR-451位于人類基因組17q11.2中，是一個多功能的miRNA，有文獻報道［11］，miR-451能夠通過靶向Psmb8抑制糖尿病腎病小鼠腎小球系膜細胞炎癥反應(yīng)，目前miR-451在膿毒癥中的表達及作用機制報道較少。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，研究miR-451在膿毒癥大鼠中的表達，并進一步探究其作用機制。

目前已經(jīng)證實TNF-α、IL-6和CRP的水平與膿毒癥病情程度密切相關(guān)，其生成情況能反映炎癥損傷的嚴重程度［12］。本研究中膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表達量較假手術(shù)組大鼠顯著升高，表明模型組大鼠已經(jīng)產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)。同時，作者在膿毒癥組大鼠血清中檢測到miR-451表達量較假手術(shù)組顯著降低，且在24 h內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。提示血清miR-451可能與TNF-α、IL-6和CRP一樣，具有評估早期膿毒癥的能力。膿毒癥大鼠的miR-451外源性干預(yù)實驗結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，注射miR-451抑制劑的膿毒癥大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表達量顯著升高，而注射miR-451模擬物的膿毒癥大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表達量顯著降低，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此結(jié)果證實miR-451能夠有效降低膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)。本研究的結(jié)論為后續(xù)更好的揭示膿毒癥與miRNA的關(guān)系提供了有效的數(shù)據(jù)支持。