陳微 徐宇嘯

近年來，我國急性心肌梗死（AMI）發(fā)病率的趨勢逐漸上升，且呈年輕化［1］。Toll樣受體（TLRs）是一種跨膜蛋白家族成員，稱為模式識別受體，是哺乳動物中唯一將細(xì)胞外抗原信息導(dǎo)入細(xì)胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的分子［2］。其中，Toll樣受體4（TLR4）在免疫防御和免疫調(diào)節(jié)中通過識別和結(jié)合多種內(nèi)源性和外源性配體扮演者重要角色［3］。核因子κB（NF-κB）是一種廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)錄因子，能特異性結(jié)合許多基因的啟動子和增強(qiáng)子，參與炎癥、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖和凋亡等多種過程［4］。已有大量研究表明NF-κB信號的激活與動脈粥樣硬化有關(guān)，而動脈粥樣硬化又是心血管疾病的重要原因［5］。然而，AMI導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制尚不完全明確。心肌缺血再灌注后的血流量恢復(fù)至缺血前的組織中，對心肌造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，降低細(xì)胞活性［6］。因此，迫切需要全面了解AMI發(fā)病過程中的機(jī)制，本研究通過觀察AMI大鼠中心肌組織TLR4、NF-κB的變化來探討其在AMI大鼠梗死區(qū)的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 紅四氮唑（TTc）購自美國Sigma公司；門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測試劑盒及HE染色試劑盒均購自北京索萊寶公司；兔TLR4多克隆抗體、兔NF-κB單克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購自碧云天生物公司。8周齡清潔級雄性SD大鼠，體重260～280g，由浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 實驗方法 （1）模型的制備與分組：35只SD大鼠于清潔級別動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫22℃～26℃，標(biāo)準(zhǔn)12h光/暗循環(huán)晝夜交替，固定飼料喂養(yǎng)，自由飲食。術(shù)前禁食＞6h，隨機(jī)將25只大鼠4%水合氯醛麻醉后，分離并結(jié)扎左冠狀動脈前降支起始部，建立AMI大鼠模型［7］，手術(shù)過程中實施心電圖監(jiān)測，以左心室前壁呈灰白至發(fā)紺、心電圖ST段抬高或T波高聳為造模成功標(biāo)志。另將剩余的10只大鼠僅分離冠狀動脈不結(jié)扎，設(shè)為假手術(shù)組。術(shù)后選取AMI建模成功且精神狀態(tài)恢復(fù)良好的大鼠20只，隨機(jī)分為模型組10只，給藥組10只。其中，給藥組在術(shù)前后進(jìn)行給藥（阿司匹林30mg/kg）干預(yù)1周，假手術(shù)組和模型組灌服等劑量的生理鹽水。給藥1周后處死大鼠，收集血清、心臟組織。（2）各組大鼠心肌酶含量檢測：各組大鼠麻醉后，開腹腔進(jìn)行腹主動脈取血，離心（3500 r/min，5min），取上清液采用全自動生化分析儀檢測心肌酶（AST、CK與CK-MB）含量。（3）各組大鼠心臟/體質(zhì)量比、心肌梗死面積的測定：取血結(jié)束后開胸腔，取心臟組織稱重，計算心臟/體質(zhì)量比；將心臟從底部至頂部水平切成5～6片于2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃染色15min，染色后正常組織呈紅色，梗死部位呈蒼白色，采用Image J軟件測量心肌梗死面積，即梗死面積/（梗死面積加上非梗死面積）×100%。（4）HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化：取部分心臟組織于4%多聚甲醛固定過夜，脫水石蠟包埋后制成2～3μm切片，水化后進(jìn)行HE染色觀察心肌組織的病理改變。（5）免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達(dá)：取心臟石蠟塊制成4～5μm切片，水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗NF-κB、TLR4（1∶50）4℃孵育過夜，次日二抗室溫孵育2h后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，快速脫水透明封片。光學(xué)顯微鏡采集圖像，每張切片隨機(jī)取10個視野，采用IPP圖像分析系統(tǒng)分析心肌組織切片的蛋白平均光密度，以此來評估NF-κB、TLR4蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。單因素方差分析組間差異，計量資料以表示；采用Pearson分析模型組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平與心肌梗死面積的相關(guān)性，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟/體質(zhì)量比、心肌梗死面積和心肌酶含量比較 見表1。

表1 各組大鼠心臟/體質(zhì)量比、心肌梗死面積和心肌酶含量（）

表1 各組大鼠心臟/體質(zhì)量比、心肌梗死面積和心肌酶含量（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n 心臟/體質(zhì)量比（10-3）心肌梗死面積（%）心肌酶AST（%） CK（%） CK-MB（%）假手術(shù)組 10 2.46±0.42 4.37±0.13 120.23±28.47 401.59±101.58 662.72±141.43模型組 10 4.53±1.12* 48.53±8.61* 159.98±67.35*421.46±129.42* 973.58±220.86*給藥組 10 3.76±0.58# 26.24±5.37# 130.11±45.22# 429.52±0.42 782.33±139.12#

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化 HE病理染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊無異常，未見炎性細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌纖維紊亂，心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)致密炎性浸潤和間質(zhì)水腫，且胞核固縮、深染；而與模型組比較，給藥組大鼠心肌組織中炎性細(xì)胞、水腫和心肌細(xì)胞損傷均有所減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化（HE，×200）

2.3 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），呈棕黃色顆粒廣泛分布；與模型組比較，給藥組的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平稍有所降低（P＜0.05）。見圖 2。

2.4 心肌組織TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)水平與心肌梗死面積的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平與心肌梗死面積呈正相關(guān)（r=0.758、0.672，均P＜0.05）。見圖 3。

3 討論

心肌缺血損傷導(dǎo)致心功能紊亂、心肌細(xì)胞凋亡在AMI發(fā)生過程中持續(xù)存在。心肌細(xì)胞受損后，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致通透性增加，細(xì)胞內(nèi)酶釋放至血液中，血清心肌酶如AST、CK等含量增加［8］。因此，通過檢測血清心肌酶水平，可間接反映心肌損傷程度。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈建立AMI模型，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟/體質(zhì)量比、心肌梗死面積和心肌酶含量均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），HE病理染色顯示心肌纖維紊亂，心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)致密炎性浸潤和間質(zhì)水腫，且胞核固縮、深染，提示大鼠AMI模型建立成功，并表現(xiàn)出心肌細(xì)胞損傷。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)圖（IHC，×200），?P＜0.05

在AMI發(fā)生過程中，局部心肌細(xì)胞死亡導(dǎo)致彌漫性炎性細(xì)胞浸潤［9］。據(jù)報道，TLRs在誘導(dǎo)心肌梗死和病毒性心肌炎等心臟病的炎癥反應(yīng)中起著重要作用［10］。既往有研究表明，在肝臟缺血/再灌注損傷中，TLR4途徑可通過直接或間接激活NF-κB信號，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促炎因子又能刺激NF-κB的活化，加重炎癥損傷［11］。TLR4是心肌細(xì)胞主要表達(dá)的Toll樣受體，在模型組的心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），且呈棕黃色顆粒廣泛分布。阿司匹林作為一種非甾體抗炎藥，是治療缺血性心臟病的臨床長期用藥之一，能防止血小板的聚集，避免血栓形成［12］。在本研究中，對AMI大鼠術(shù)前、術(shù)后給予阿司匹林進(jìn)行干預(yù)1周發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，給藥組大鼠心臟/體質(zhì)量比和心肌組織梗死面積均明顯低于模型組（P＜0.05），心肌酶除了CK變化不明顯外，AST與CK-MB均較模型組有所降低（P＜0.05），病理染色顯示心肌組織中炎性細(xì)胞、水腫和心肌細(xì)胞損傷均有所減輕，心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平也稍有所降低（P＜0.05）。提示阿司匹林可能通過抑制TLR4/NF-κB信號途徑來發(fā)揮其保護(hù)作用，減輕AMI導(dǎo)致的心肌損傷［13］。最后，為了進(jìn)一步分析TLR4/NF-κB信號途徑在AMI大鼠梗死區(qū)的作用，采用Pearson分析AMI大鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平與心肌梗死面積的相關(guān)性，結(jié)果顯示TLR4、NF-κB與心肌梗死面積呈正相關(guān)（P＜0.05），提示TLR4/NF-κB可能參與了心肌梗死的過程，可能是AMI發(fā)生的重要預(yù)測性生物標(biāo)記物，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

綜上所述，TLR4/NF-κB信號通路在AMI大鼠模型中表達(dá)升高，可能在心肌梗死過程中發(fā)揮著重要作用，為TLR4/NF-κB作為AMI治療靶點提供了新的依據(jù)。