施楠婧 馬麗珍

局部節(jié)段性腎小球硬化癥（Focal Segmental Glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS） 是 慢 性 腎 臟 ?。–hroic Kidney Disease，CKD）的常見組織病理學(xué)病變，占全球原發(fā)性腎小球疾病的2%～41%［1］。FSGS主要表現(xiàn)為腎病綜合征，會持續(xù)進(jìn)展為終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease，ESRD）。數(shù)據(jù)表明，美國近幾十年來由FSGS引起的ESRD急劇增加，尤其是黑人中，約占成年人ESRD的4%［2］。據(jù)報道，F(xiàn)SGS可能通過體內(nèi)活性氧種類的變化，自噬功能的損害，促炎細(xì)胞和補(bǔ)體的增加等多種途徑損傷足細(xì)胞［3］。但FSGS的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，迫切需要更深入研究。本研究通過生物信息學(xué)方法，提取基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中16例FSGS和21例正常腎小球組織標(biāo)本信息，通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）篩選與FSGS相關(guān)的模塊和樞紐基因，并通過從開放數(shù)據(jù)庫中獲得的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從公開的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫 GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/）中下載獲取本研究中表達(dá)譜芯片GSE104948，包括18例正常腎小球組織和21例FSGS患者的腎小球組織的芯片數(shù)據(jù)［4］。本研究下載并使用原始數(shù)據(jù)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行探針注釋、異常樣本排除、無方差基因過濾的統(tǒng)一預(yù)處理。

1.2 WGCNA 利用R語言中的WGCNA軟件包［5］進(jìn)行WGCNA。首先將表達(dá)譜轉(zhuǎn)換成Pearson相關(guān)矩陣，該矩陣是通過計(jì)算基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)形成的。其次構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，以無尺度網(wǎng)格指數(shù)（R2）=0.8作為滿足無尺度條件的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)平均連接度確定軟閾值（β值）。再將該矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣（Topological Overlap Matrix，TOM）后，通過對基因構(gòu)建層次聚類樹圖形，采用動態(tài)剪枝法計(jì)算基因模塊的顏色，將加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的基因分為不同的模塊，并合并相似度＞0.75的模塊，找出與FSGS發(fā)生相關(guān)性最高的模塊即為樞紐模塊。為了進(jìn)一步驗(yàn)證樞紐模塊的價值，計(jì)算相關(guān)模塊內(nèi)基因顯著性（GS）及基因在模塊內(nèi)的模塊隸屬度（MM）［5］。并對樞紐模塊內(nèi)基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）注釋［6］和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析［7］。利用R語言中的clusterProfiler軟件包［8］進(jìn)行可視化分析。均取數(shù)據(jù)庫中結(jié)果P＜0.01和Benjamin-Hochberg校正P＜0.01為統(tǒng)計(jì)顯著性閾值。

1.3 基因表達(dá)差異分析 使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Reads count 評估基因表達(dá)水平，利用R語言中的limma軟件包［9］對數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件為log FC絕對值＞1，P值＜0.01，并利用R語言中的heatmap軟件包［10］對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.4 子網(wǎng)絡(luò)的提取與樞紐基因的鑒定 從樞紐模塊最顯著GO分析項(xiàng)中提取了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件［11］進(jìn)行差異表達(dá)基因的樞紐基因的鑒定，利用具有最大團(tuán)中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）的分析方法［12］對子網(wǎng)絡(luò)的中心性進(jìn)行了評估。MCC值最高的基因即為FSGS中潛在的樞紐基因。同時利用Nephroseq芯片數(shù)據(jù)庫（https：//www.nephroseq.org/resource/login.html）驗(yàn)證樞紐基因的臨床意義，該數(shù)據(jù)庫提供了腎臟相關(guān)的表達(dá)譜以及臨床信息，例如肌酐、腎小球?yàn)V過率和蛋白尿等。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 本研究下載原始數(shù)據(jù)后進(jìn)行歸一化、對數(shù)化，探針注釋后共獲得11884個基因的表達(dá)譜。在樣本聚類和異常樣本排除后保留了21例正常和16例FSGS樣本的表達(dá)譜，見圖1。再刪選出基因表達(dá)量方差大于所有方差四分位數(shù)的基因共得到5942個基因用于后續(xù)分析。

圖1 FSGS與正常對照的臨床性狀熱圖聚類樹狀圖

2.2 WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)模塊 當(dāng)無尺度網(wǎng)絡(luò)指數(shù)＞0.8時，β=9，其平均連接度最高，見圖2。采用動態(tài)分層剪切樹法將5942個基因分為9個共表達(dá)模塊，以顏色的英文命名，其中g(shù)rey模塊表示未納入任何模塊的基因集合（含167 基因），見圖3A。所有分析基因的相關(guān)性熱圖顯示，見圖3B?；蛑饕c同一模塊的基因共表達(dá)，與不同模塊的基因共表達(dá)關(guān)系較弱。通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估模塊與臨床特征之間的相關(guān)性，見圖4A。brown模塊與FSGS具有最高的正相關(guān)系數(shù)，因此被確定為進(jìn)一步分析的樞紐模塊（FSGS相關(guān)模塊）。同時，對此模塊的GS與MM值的相關(guān)性進(jìn)行了分析（cor=0.83，P＜1E-200，圖4B），再次表明了模塊-性狀相關(guān)關(guān)系的可靠性。

圖2 選擇合適的軟閾值（β值）

圖3 模塊劃分與驗(yàn)證

圖4 FSGS相關(guān)模塊的識別與驗(yàn)證

2.3 FSGS相關(guān)模塊基因的富集分析及差異表達(dá)分析 對FSGS相關(guān)模塊的基因進(jìn)行了富集分析，GO生物過程中主要與免疫細(xì)胞的活化相關(guān)，如白細(xì)胞遷移、T細(xì)胞活化、血管發(fā)育的調(diào)節(jié)。GO分子功能中主要與生長因子結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合和細(xì)胞因子受體結(jié)合相關(guān)。GO細(xì)胞成分主要與細(xì)胞膜的外側(cè)、細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)合、局灶性粘附。KEGG通道富集分析的結(jié)果與GO生物過程相似，基因與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、趨化因子信號途徑和細(xì)胞粘附分子等密切相關(guān)。對FSGS相關(guān)模塊中的基因進(jìn)行了差異表達(dá)分析，總共獲得了74個差異表達(dá)基因，包括68個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因。與模塊特征關(guān)系分析的結(jié)果一致，F(xiàn)SGS相關(guān)模塊中的大多數(shù)基因異常上調(diào)。

2.4 子網(wǎng)的挖掘和樞紐基因的鑒定 選取GO生物過程中最相關(guān)的“白細(xì)胞遷移”進(jìn)一步分析，從整個共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中提取基因及其加權(quán)鄰接關(guān)系，構(gòu)建一個子網(wǎng)絡(luò)。基于CytoHubba插件利用MCC分析方法評估了前500個加權(quán)鄰接關(guān)系的基因的中心性。MCC值最高的前10位的樞紐基因以黃色和紅色為主，顏色約紅表示MCC值約高，CD48具有較高的MCC值，見圖5。進(jìn)一步篩查FSGS與正常對照之間CD48的差異表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CD48是與FSGS相關(guān)的顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因（logFC=1.629，P=4.63E-11），即為FSGS發(fā)病機(jī)理的中心樞紐基因。同時利用Nephroseq芯片數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證樞紐基因的相關(guān)臨床意義，在21例正常樣本和25例FSGS樣本的數(shù)據(jù)集分析結(jié)果提示CD48在FSGS腎小球組織中明顯過表達(dá)，見圖6A。此外，F(xiàn)SGS患者中CD48和GFR呈負(fù)相關(guān)，見圖6B，提示CD48的增加可能致腎功能惡化。

圖5 從整個共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中提取子網(wǎng)絡(luò)

圖6 CD48在FSGS中的臨床意義驗(yàn)證

3 討論

近幾十年來，F(xiàn)SGS已成為慢性腎臟疾病的主要原因。由于該疾病的發(fā)病機(jī)理尚未發(fā)現(xiàn)，并且無針對FSGS的靶向治療，因此該疾病的預(yù)后并不樂觀。因此，更好地闡明其致病機(jī)制并為該疾病提取新的潛在治療靶標(biāo)已迫在眉睫。WGCNA是一種重要的生物信息學(xué)工具，可以根據(jù)相似的表達(dá)模式確定基因共表達(dá)關(guān)系，將基因分為多個共表達(dá)模塊，識別與疾病有重要關(guān)系的模塊并進(jìn)行顯著性關(guān)聯(lián)分析［4］。WGCNA已被廣泛用于發(fā)現(xiàn)不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

本研究利用WGCNA處理21例正常和16例FSGS標(biāo)本基因的數(shù)據(jù)，共篩選出5942個基因，8個共表達(dá)模塊，其中brown模塊（FSGS相關(guān)模塊）被認(rèn)為與FSGS顯著相關(guān)，對其行GO和KEGG富集分析，主要富集于炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用等生物學(xué)方面，且此模塊中大部分差異表達(dá)基因都是上調(diào)的。從GO富集分析中篩選出最有意義的白細(xì)胞遷移，構(gòu)建共表達(dá)子網(wǎng)絡(luò)，用MCC法確定該網(wǎng)絡(luò)核心的CD48基因?yàn)闃屑~基因。同時在Nephroseq芯片數(shù)據(jù)庫檢測發(fā)現(xiàn)CD48在FSGS患者的腎小球組織中明顯過表達(dá)且CD48表達(dá)與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)，提示CD48可能在FSGS的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮作用，但具體的機(jī)制仍需深入研究。

CD48基因位于1號染色體的1q21-23帶［13］，編碼分子量為40～45kD的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白［14］。CD48廣泛存在于免疫細(xì)胞表面，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞［15］。CD48在涉及信號蛋白復(fù)合物中具有高度的運(yùn)動性和聚集性［16］。但目前尚無相關(guān)報道說明腎小球組織中異常上調(diào)的CD48表達(dá)水平與FSGS相關(guān)。

因此，為了探究CD48在FSGS發(fā)生和發(fā)展中的作用，重點(diǎn)研究了其他與FSGS較相關(guān)的MCC值較高的基因，如CD44、PYCARD、LYN、FCER1G、ITGAM等。CD44在嚙齒動物和人類的正常耳道組織中幾乎未檢測到，但在FSGS足細(xì)胞損傷后，腎小球壁上皮細(xì)胞（PEC）中急劇增加［17-18］，提示PECs中CD44的上調(diào)可能在腎小球硬化中起重要作用。而小鼠實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，腎小球中PECs中CD44的激活與FSGS的進(jìn)展有關(guān)［19］。此外，CD44還與蛋白尿和血清肌酐呈正相關(guān)［20］。CD44陽性的腎小球細(xì)胞已被廣泛證實(shí)是FSGS致病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。本研究中，作者通過WGCNA證實(shí)CD48與CD44具有高度的正相關(guān)關(guān)系，并通過皮爾遜相關(guān)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了共表達(dá)關(guān)系（cor=0.805，P=1.831E-09）。且CD48的表達(dá)水平與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果提示CD48可能通過與CD44共同表達(dá)的方式參與FSGS的發(fā)病。PYCARD編碼人細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白，已有研究發(fā)現(xiàn)PYCARD與急進(jìn)性腎小球腎炎的炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞活化相關(guān)［21］。LYN是編碼酪氨酸蛋白激酶的基因，已證實(shí)LYN可通過抑制阻止纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1，一種強(qiáng)有力的促纖維化介質(zhì)）減少慢性移植腎?。–AN）的纖維化［22］。有研究者揭示FCER1G在子宮內(nèi)膜異位病變中產(chǎn)生纖維化和粘連的作用［23］。ITGAM是一種編碼整聯(lián)蛋白的基因，據(jù)報道，ITGAM可以加速腎小球和腎小管損傷和腎纖維化［24］。雖然這些基因?qū)SGS的影響尚不清楚，但它們在其他腎病中的作用以及與CD48的明顯共表達(dá)關(guān)系，可能為FSGS的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。

綜上所述，本研究通過WCGNA構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，初步得到與FSGS發(fā)病相關(guān)的樞紐基因CD48，為FSGS提供了潛在的特異性標(biāo)志物和新的治療靶標(biāo)。