邵帥，江梅，丁濤，姜經(jīng)航，王開(kāi)秀，王婷婷，李長(zhǎng)超

(湖北省荊門(mén)市第二人民醫(yī)院，1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.檢驗(yàn)科，荊門(mén) 448000)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)又稱“第二代試管嬰兒”，是直接將單個(gè)精子注射到卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，使其受精形成胚胎進(jìn)行移植受孕。ICSI是在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的顯微受精技術(shù)，常用于男性嚴(yán)重少弱畸精子癥、無(wú)精子以及IVF受精失敗等的治療[1]。ICSI 技術(shù)對(duì)精子的要求比較低，受精率高，是目前治療男性不育最有效的技術(shù)[2]。雖然 ICSI 在臨床上的應(yīng)用比較成熟，但I(xiàn)CSI 操作的步驟包括透明質(zhì)酸酶的作用、機(jī)械去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞、精子的制動(dòng)、注射針對(duì)卵母細(xì)胞的侵入性操作、精子頂體注射以及精子制動(dòng)液注射到卵母細(xì)胞內(nèi)等各個(gè)環(huán)節(jié)都可能影響胚胎以及后代的發(fā)育，具有潛在的遺傳風(fēng)險(xiǎn)[3-4]；而且ICSI技術(shù)避開(kāi)了精子自然選擇的過(guò)程，可能會(huì)增加新生兒出生缺陷的患病率[5]。由此引發(fā)ICSI 出生后代是否與自然出生的人群存在安全性、遺傳性及其他方面的差異尚不可知。因此，本文主要對(duì)ICSI導(dǎo)致的先天畸形、表觀遺傳疾病、染色體異常、不育、代謝性疾病、癌癥等研究做一綜述，以便為生殖中心的ICSI規(guī)范操作提供相關(guān)依據(jù)。

一、先天性畸形

先天性畸形是指先天結(jié)構(gòu)或功能異常，可能是由遺傳或多種因素造成的，但在大多數(shù)情況下原因未知。2015年加利福利亞的一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，ICSI應(yīng)用于非男性因素不孕時(shí)，與IVF相比會(huì)增加自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)[6]。此外，美國(guó)國(guó)家輔助生殖技術(shù)中心監(jiān)測(cè)系統(tǒng)從1996年至2012年的數(shù)據(jù)顯示，在非男性因素不孕患者治療中，與傳統(tǒng)IVF相比，ICSI出生新生兒伴隨著低出生體重率和低多胎率；而在植入率、妊娠率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率和低出生體重等方面，男性因素與非男性因素不孕癥的結(jié)果并無(wú)顯著性差異[7]。Tararbit等[8]發(fā)現(xiàn)，ICSI出生新生兒與法洛四聯(lián)癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，但與其他先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)。Lacamara等[9]通過(guò)系統(tǒng)回顧和Meta分析發(fā)現(xiàn)，ICSI單胎妊娠出生的新生兒與自然受孕的新生兒相比，發(fā)生先天性畸形的風(fēng)險(xiǎn)更高；同時(shí)研究結(jié)果也顯示輔助生殖技術(shù)(ART)存在相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，包括配子體外操作、胚胎冷凍與解凍等；除了與父母特征相關(guān)的因素如母親或父親的年齡、男性不育因素外，先天性畸形的發(fā)生還與社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、妊娠期間使用的藥物、誘發(fā)卵巢過(guò)度刺激的方法等有關(guān)。然而，Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在IVF和ICSI的新生兒出生缺陷中，不管單胎還是雙胎其發(fā)生率均無(wú)顯著性差異；在評(píng)估凍融胚胎移植(FET)出生新生兒時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)IVF出生新生兒和ICSI出生新生兒之間存在出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于AZF微缺失的患者，應(yīng)用ICSI也可以獲得良好的臨床妊娠結(jié)局，ICSI患者與非ICSI患者出生的新生兒結(jié)局無(wú)顯著性差異[11]。Jwa等[12]并未發(fā)現(xiàn)與ICSI出生新生兒相關(guān)的先天性畸形風(fēng)險(xiǎn)增加，即使分析ICSI獲得的凍融胚胎以及移植不同發(fā)育階段胚胎，也得出同樣的結(jié)論。

綜上所述，經(jīng)ART助孕新生兒和先天性畸形風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系仍然不明確，這可能與個(gè)體異質(zhì)性、研究設(shè)計(jì)的針對(duì)性、選擇偏倚以及Meta分析限制等導(dǎo)致的畸形總數(shù)偏低有關(guān)。鑒于患者的疾病和ICSI適應(yīng)證也可能與畸形風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，因此將較高的遺傳風(fēng)險(xiǎn)完全歸因于ICSI似乎有些牽強(qiáng)。

二、表觀遺傳疾病

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變。表觀遺傳學(xué)主要通過(guò)DNA修飾、蛋白質(zhì)修飾與非編碼 RNA 調(diào)控 3個(gè)層面上調(diào)控基因表達(dá)。Choux等[13]通過(guò)前瞻性研究將IVF/ICSI單胎妊娠結(jié)局和自然妊娠結(jié)局進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)IVF/ICSI胎盤(pán)樣本中一些轉(zhuǎn)位因子和印跡基因發(fā)生了甲基化和轉(zhuǎn)錄改變，表明IVF/ICSI可能會(huì)導(dǎo)致胎盤(pán)表觀遺傳改變。研究表明，IVF/ICSI與H19甲基化顯著降低、IGF2和SNRPN甲基化顯著升高相關(guān)，而印跡基因表達(dá)異常和DNA甲基化可能與印跡障礙和其他生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)疾病有關(guān)，需要進(jìn)一步調(diào)查ART對(duì)健康的長(zhǎng)期影響[14]。在不育男性檢查中發(fā)現(xiàn)印跡基因GTL 2和H19 異常表達(dá)，表明男性不育與精子中印跡位點(diǎn)甲基化異常相關(guān)，一些少精子癥患者精子中存在的印跡位點(diǎn)甲基化異?，F(xiàn)象，通過(guò)ICSI能夠遺傳給后代[15]。Hattori等[16]研究認(rèn)為，與ART相關(guān)的印記障礙可能傾向于在受精后不久出現(xiàn)，即在表觀基因組最脆弱的時(shí)候發(fā)生，并可能受到ICSI操作技術(shù)及受精卵培養(yǎng)基組分的影響。外源性促性腺激素刺激引發(fā)的卵巢相關(guān)激素改變和成熟卵母細(xì)胞的采集均可導(dǎo)致ART助孕新生兒的表觀遺傳障礙或印跡缺陷風(fēng)險(xiǎn)的增加。此外，受精操作和胚胎培養(yǎng)條件可能會(huì)改變DNA甲基化狀態(tài)，從而增加印跡障礙的風(fēng)險(xiǎn)。

研究人群和組織樣本的異質(zhì)性以及不同的實(shí)驗(yàn)室操作方法可能導(dǎo)致了模棱兩可的結(jié)果。但顯而易見(jiàn)，雖然自然受孕的新生兒和ART受孕的新生兒之間確實(shí)存在著印跡和表觀遺傳的差異，但這種差異對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響是微乎其微的。

三、染色體異常

ICSI已成為治療男性不育癥的首選方法，但由于不育患者的精子染色體異常頻率升高，妊娠頭3個(gè)月的染色體非整倍體率可能會(huì)增加。染色體分離異常會(huì)引起成熟生殖細(xì)胞的染色體異常，并導(dǎo)致胚胎染色體異常。事實(shí)上，非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)畸變是導(dǎo)致受精失敗、植入失敗、自然流產(chǎn)、死胎、先天性畸形以及精神和行為功能障礙的主要因素。因此，不育夫婦進(jìn)行ICSI治療時(shí)，后代染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增加，因?yàn)檫@種技術(shù)通過(guò)注射染色體異常精子會(huì)使染色體非整倍體遺傳給下一代。

男性因素不育治療中，ICSI助孕可以提高受孕成功率，但也增加了非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)重排的發(fā)生率，導(dǎo)致妊娠率和著床率偏低而流產(chǎn)率偏高[17]。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)ICSI受孕的后代染色體異常發(fā)生率偏高，特別是后代性染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)比自然受孕和IVF受精的后代更高[18]；但Belva等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生新生兒核型異常率為3.2%，主要與大量新發(fā)常染色體異常有關(guān)，而非與性染色體異常有關(guān)；在產(chǎn)前和產(chǎn)后取樣的聯(lián)合組中，發(fā)現(xiàn)了1.9%的新生兒染色體異常率且高于一般人群，這與父親的精子數(shù)量有關(guān)。由于以上結(jié)果均出自男性不育癥文獻(xiàn)，因此有理由認(rèn)為ICSI出生新生兒的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)與不育父親的低質(zhì)量精子有關(guān)，而非ICSI技術(shù)本身。

四、不育

ICSI自1992年誕生以來(lái)，至今才有20多年，對(duì)ICSI出生后代的生育狀況檢測(cè)尚有諸多不便。因?yàn)槟行圆挥赡軙?huì)損害睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能和降低血清睪丸激素水平，而3月齡時(shí)垂體-睪丸軸暫時(shí)活躍，因此3月齡的嬰兒血清睪丸激素可以作為ICSI成年生殖功能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，據(jù)此可以比較ART出生的嬰兒和自然受孕嬰兒的睪丸功能。研究顯示：ICSI出生男孩和IVF出生男孩的血清生殖激素[FSH、LH、抑制素B和睪酮(T)]水平無(wú)顯著性差異；因男性因素不育采用ICSI出生男孩的血清總T和游離T水平顯著低于自然受孕出生男孩，而LH/T比率高于自然受孕出生男孩；因女性因素不孕采用IVF助孕出生男孩和自然受孕出生男孩的血清生殖激素比較無(wú)顯著性差異；提示ICSI出生男孩的睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能受損，可能遺傳自父親，因此成年后需進(jìn)行生殖健康檢查[20-22]。Catford等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與同齡的正常男孩相比，因男性因素不育采用ICSI出生的3月齡男孩的血清T較低，LH/T比率較高；ICSI出生的年輕成年男性精子發(fā)生障礙，精液質(zhì)量下降，還有較高的FSH水平和較低的抑制素B水平。Belva等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生男孩的青春期內(nèi)分泌功能正常，但唾液T水平以及抑制素B水平等在成年早期不正常，并且ICSI出生青年男性的精液質(zhì)量和數(shù)量均有所下降；通過(guò)ICSI助孕導(dǎo)致精子發(fā)生異常的代際遺傳可能性有待進(jìn)一步研究。

Y染色體微缺失通過(guò)ICSI傳遞給男性后代，導(dǎo)致其有很高的不育風(fēng)險(xiǎn)，如核型為inv(9)(p11q13)就可以通過(guò)ICSI傳給后代；某些Y染色體微缺失，包括最常見(jiàn)的gr/gr微缺失，不一定會(huì)導(dǎo)致后代男性不育，但會(huì)增加不育的風(fēng)險(xiǎn)。Y染色體缺失的男性患者其女性后代不會(huì)增加患先天性異?；虿辉邪Y的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì) Y染色體微缺失男性不育患者行ART治療時(shí)，可以進(jìn)行特定的產(chǎn)前診斷(包括胚胎植入前遺傳學(xué)診斷)，以篩查胎兒性別或者確定是否存在Y染色體微缺失[25]。

ART出生的女性后代其生育狀況的數(shù)據(jù)很少。有研究顯示，ART出生的18～22歲女性與自然受孕出生的女性對(duì)照組相比，兩組間血清抗苗勒管激素、FSH水平及竇卵泡計(jì)數(shù)比較均無(wú)顯著性差異[22]。

以上研究表明，ICSI出生的男性后代可能會(huì)存在源自父系的生育能力缺陷，而ICSI出生的女性后代因現(xiàn)有資料太少，無(wú)法對(duì)其生育能力作出任何推測(cè)。

五、代謝性疾病

ART過(guò)程包括卵巢刺激、配子操作和胚胎培養(yǎng)等，都發(fā)生在基因組甲基化模式建立的關(guān)鍵窗口期。有研究者認(rèn)為，DNA甲基化的改變會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并可能增加兒童和成人患心臟代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)[26]。肥胖或超重婦女的胚胎常常表現(xiàn)出發(fā)育和代謝狀況不佳，究其原因，肥胖或超重婦女的卵母細(xì)胞比正常女性的卵母細(xì)胞要小，發(fā)育成囊胚期的概率降低，為促進(jìn)其發(fā)育，滋養(yǎng)外胚層的細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少，從而對(duì)著床和胚胎產(chǎn)生負(fù)面影響；這些胚胎也表現(xiàn)出明顯的代謝變化，葡萄糖消耗減少、氨基酸代謝改變、甘油三酸酯水平增加等，可能對(duì)后代有潛在的不良影響。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，胚胎所處的微環(huán)境若發(fā)生根本性的變化，可能會(huì)導(dǎo)致心臟代謝途徑發(fā)生永久性的改變[27]。Kosteria等[28]通過(guò)血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ICSI出生的孩子中有19個(gè)高表達(dá)蛋白和3個(gè)低表達(dá)蛋白，大多數(shù)過(guò)表達(dá)蛋白與急性期反應(yīng)、凝血、補(bǔ)體通路激活以及鐵和脂代謝有關(guān)，提示亞臨床不良的心臟代謝特征。Vlachopoulos等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ART后代中血清前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)水平隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，提示心血管風(fēng)險(xiǎn)的增加可能與其導(dǎo)致的血脂狀況的逐漸惡化有關(guān)；與ICSI相比，IVF治療伴隨較高水平的脂蛋白a[Lp(a)]。其他研究表明，在IVF/ICSI出生的后代中，新生兒、嬰兒和兒童的生長(zhǎng)發(fā)育與血壓呈正相關(guān)，兒童生長(zhǎng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能呈負(fù)相關(guān)[30]。ICSI出生的男性后代其體內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)的平均濃度較低，而代謝綜合征的其他標(biāo)志物則不受受孕方式的影響[31]。

六、癌癥

丹麥的一項(xiàng)調(diào)查研究顯示，1996至2015年出生兒童中，F(xiàn)ET出生兒童與自然生育的兒童患癌比例分別為44.4/100 000和17.5/100 000，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[32]。一項(xiàng)系統(tǒng)回顧性分析顯示，與自然受孕的后代相比，ART出生后代的患癌風(fēng)險(xiǎn)總體增加；在對(duì)癌癥類型的分析中發(fā)現(xiàn)，ART出生后代罹患特定類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)有所增加，包括肝母細(xì)胞瘤和橫紋肌肉瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、惡性上皮腫瘤、白血病以及霍奇金淋巴瘤[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，有生育問(wèn)題女性的后代患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)總體上有所增加，這可能與母親遺傳有關(guān)[34]；是否存在其他潛在的致癌因素還未可知，有可能先天因素才是(兒童)癌癥的最重要原因而非ART技術(shù)所致。因此，建議進(jìn)行更多的相關(guān)研究。然而Spaan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與自然受孕的兒童或與普通人群相比，ART出生的后代總體患癌風(fēng)險(xiǎn)并沒(méi)有增加，ICSI或FET出生的兒童患癌風(fēng)險(xiǎn)有輕微但不顯著的增加；與自然受孕的兒童相比，ART受孕的兒童發(fā)生淋巴細(xì)胞白血病和黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著增加。不同類型的癌癥可能有不同的病因，盡管ART治療后出生的兒童總體患癌風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有增加，但某些特定類型的癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)有所增加。在ART分層分析中，ICSI和常規(guī)體外受精兒童間的癌癥發(fā)生率無(wú)顯著性差異。

總 結(jié)

ICSI技術(shù)的問(wèn)世給男性不育患者的治療帶來(lái)了希望，是一項(xiàng)革命性的技術(shù)突破。畢竟至今只有28年的應(yīng)用時(shí)間，所以ICSI的安全性一直備受人們的廣泛關(guān)注。不可否認(rèn)，大部分研究認(rèn)為ICSI子代和自然妊娠兒童健康狀況相似，ICSI是相對(duì)安全的；除了以上ICSI出生后代相關(guān)問(wèn)題需要擔(dān)憂以外，還有神經(jīng)系統(tǒng)及認(rèn)知發(fā)育、社會(huì)心理發(fā)育、子代出生缺陷等方面也值得關(guān)注和擔(dān)憂。因此，ICSI技術(shù)的安全性仍值得關(guān)注，有待大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間的隨訪。