李文強，李愛杰，張云，岳金波

1 濰坊醫(yī)學院臨床學院，山東濰坊261053；2 山東省腫瘤醫(yī)院

結腸癌是常見的惡性腫瘤，世界每年發(fā)病患者例數(shù)約110萬，我國結腸癌發(fā)病率不斷升高，并且有年輕化的趨勢［1-2］。目前結腸癌的發(fā)病機制還未闡明，可能與遺傳因素、飲食結構、經(jīng)濟狀況等有關。因此，探究結腸癌的致病因素對疾病預防及早期篩查意義重大。非編碼RNA 是無蛋白編碼功能的RNA 分子，近年來研究表明，其在調控基因表達、染色質重構等過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，與炎癥、免疫及癌變的發(fā)生發(fā)展有關［3］。長鏈非編碼RNA（ln?cRNA）X 染色體失活特異性轉錄本基因（XIST），位于Xq13.2，該基因是X 染色體上失活中心區(qū)域中第一個鑒定出的非編碼基因，對X 染色體失活的啟動和維持至關重要。研究表明，lncRNA XIST 在多種腫瘤中異常表達，并影響腫瘤細胞的增殖及轉移等惡性生物學行為［4-5］。微小 RNA（miR）-32-5p 位于9q31.3，可調控多條細胞信號傳導通路，其作為一種抑癌基因，在非小細胞肺癌［6］、口腔鱗癌［7］等惡性腫瘤中表達失調，促進腫瘤的惡性進展?；蛟鰪娮拥娜祟愅椿颍‥ZH2）位于7q36.1，該基因編碼蛋白是多梳蛋白PcG 家族成員之一，具有多梳抑制復合物2（PRC2）的催化亞基，參與維持基因表達的調控，在細胞分裂增殖、染色體重構及腫瘤發(fā)生等生理病理過程中起重要的調節(jié)作用［8］。有學者在結直腸癌HCT-8 腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，lncRNA XIST 通過抑制miR-32-5p 的表達，促進EZH2 的表達，促進HCT-8細胞的增殖及遷移等惡性生物學行為［9］。本研究觀察了結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2018 年 8 月—2019 年 8 月于山東省腫瘤醫(yī)院診治的86 例結腸癌患者的臨床病理資料。納入標準：患者均經(jīng)組織病理學檢查明確；患者均為首次診治，無放化療治療史；住院期間相關檢查及病理資料完整，患者已簽署知情同意書。排除標準：伴腸道急慢性感染性疾病；既往罹患惡性腫瘤病史；伴心肺肝腎功能障礙。結腸癌患者中男51例，女35例；年齡27～78（52.4 ± 7.1）歲；腫瘤位置：直腸31 例，結腸55 例；伴淋巴結轉移20 例，無淋巴結轉移 66 例；腫瘤直徑：≤3 cm 者 60 例，>3 cm 者 26例；腫瘤分期：Ⅰ期 23 例，Ⅱ期 33 例，Ⅲ期 24 例，Ⅳ期6 例；腫瘤分化程度：高分化26 例，中分化28 例，低分化32例。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過。

1.2 組織中 lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 檢測 各取癌組織及癌旁組織（距離癌組織5 cm 以上）約50 mg，剪碎后研缽中加液氮研磨，加入1 mL TRIzol 后重懸，利用TRIzol 法提取癌組織及癌旁正常組織中的RNA。將獲取的RNA 產(chǎn)物按照試劑盒說明書反轉錄為cDNA，分光光度計檢測cDNA 濃度及 純度 ，cDNA 的 OD260/OD280在 1.8～2.1。 lncRNA XIST 正向引物序列：5"-TTGGGGAACCACCTA?CACTTGAG-3"，反向引物序列：5"-CCATTTTGCTAT?GCGTTATCTGA-3"；EZH2 正向引物序列：5"-CCCT?GACCTCTGTCTTACTTGTGGA-3"，反向引物序列：5′-ACGTCAGATGGTGCCAGCAATA-3′；內參基因GAPDH 正向引物序列：5"-ACAGCCTCAAGATCAT?CAGC-3"，反向引物序列：5"-GGTCATGAGTCCTTC?CACGAT-3"；miR-32-5p 上游引物序列：5"-ACACTC?CAGCTGGGTACAGTATAGATGATGTACT-3"，下 游引物序列：5"-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3"；內參基因U6 上游引物序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。總反應體系20 μL，其中Master Mix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNA-free 水8μL。LncRNA XIST 及 EZH2 反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 20 s，共40 個循環(huán)。miR-32-5p 反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 50 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算 lncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；各指標相關性用Pearson 線性相關進行分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌與癌旁組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p及 EZH2 表達比較 lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 在結腸癌組織中相對表達量分別為2.172 ±0.243、0.544 ± 0.085、1.283 ± 0.212，在癌旁組織中分別為 1.079 ± 0.084、1.651 ± 0.122、0.479 ±0.110，癌組織中 lncRNA XIST、EZH2 相對表達量高于癌旁組織（t=39.423、31.218，P均<0.01），miR-32-5p低于癌旁組織（t=69.042，P<0.01）。

2.2 結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達與患者臨床病理特征的關系 癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表達與腫瘤分期有關（P均<0.05），見表1。

2.3 結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達的相關性 結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST與 miR-32-5p 呈負相關（r=–0.612，P<0.01），miR-32-5p 的相對表達量與EZH2 的相對表達量呈負相關（r=–0.608，P<0.01），而lncRNA XIST與EZH2的相對表達量無明顯相關性（r=0.375，P=0.284）。

3 討論

結腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率在惡性腫瘤中排第三［10］。結腸癌的治療包括手術治療、放化療及生物靶向治療等。早期患者首選手術治療，但晚期轉移患者即使經(jīng)積極綜合治療仍預后不佳。因此，需深入研究結腸癌的病因及發(fā)病機制，尋找新的診斷治療靶點［11］。結腸癌的發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素及腸道疾病等有關，各種因素綜合作用，促進腸黏膜上皮細胞中癌基因的表達，導致細胞的惡性轉化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ln?cRNA、miRNA 等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，其可通過轉錄及轉錄后等機制調控下游癌基因的表達，促進腫瘤細胞增殖及轉移、抑制凋亡等，有助于腫瘤診斷及治療［12］。

lncRNA 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA。研究表明，lncRNA 在炎癥、自身免疫及腫瘤等多種疾病中均發(fā)揮重要的調控作用，lncRNA 的異常表達影響疾病的發(fā)生發(fā)展［13］。lncRNA XIST 結構上具有X 染色體滅活中心域，是近年來發(fā)現(xiàn)的參與調控哺乳動物雌性早期發(fā)育過程X染色體失活的非編碼RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌［4］、胃癌［5］等多種腫瘤中l(wèi)ncRNA XIST 表達升高，其通過表觀遺傳學調控下游上皮間質轉化基因如E-鈣黏素、N-鈣黏素等的表達，促進腫瘤的惡性增殖、浸潤和轉移［14］。本研究中，結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 表達升高，可能與調控其表達的上游分子異常有關。多數(shù)長非編碼基因由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄，并且具有組織和時間的特異性，腫瘤發(fā)生時某些因子如lncRNA增強子相關因子，能夠促進RNA 聚合酶Ⅱ結合到lncRNA XIST基因啟動子區(qū)域，導致 lncRNA XIST 表達升高［15］。此外，lncRNA XIST 表達與腫瘤分期有關，其原因可能是lncRNA XIST 的過表達能夠通過分子海綿抑制miR-137 的表達，進而導致notch1 的過度激活，促進上皮間質轉化過程的關鍵轉錄因子Snail的表達，降低腫瘤細胞之間上皮性標志E-鈣黏素表達，而升高間質性表型如N-鈣黏素、波形蛋白等的表達，增強腫瘤的浸潤及轉移能力［16］。miRNA 是長度為19～25 個核苷酸RNA 分子，可構成RNA 誘導的沉默復合物（RISC），RISC 結合靶基因mRNA 的3"非編碼區(qū)（UTR），通過影響mRNA 進而達到調控基因的效果。miR-32-5p 是一種發(fā)揮腫瘤抑制功能的miRNA。研究表明，miR-32-5p 在非小細胞肺癌、結直腸癌等惡性腫瘤中表達降低，導致其下游癌基因ERBB2 轉導子1 的表達增加，進而增強腫瘤細胞的增殖及浸潤能力［6，17］。本研究中，結腸癌組織中 miR-32-5p 表達較癌旁組織低，其機制是miR-32-5p 的表達受ln?cRNA，如lncRNA GAS5 的表達調控。有研究表明，結直腸癌中l(wèi)ncRNA GAS5 的表達增加，而lncRNA GAS5 能作為分子海綿結合并抑制miR-32-5p 的表達，導致癌組織中 miR-32-5p 表達降低［18］；此外，結腸癌高腫瘤分期患者miR-32-5p 表達低于低分期患者，提示miR-32-5p 低表達促進結腸癌的疾病進展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p 能結合轉錄因子Kruppel 樣因子 4（KLF4）mRNA 的 3"UTR，促進 KLF4 mRNA 的降解，抑制KLF4 的表達。但腫瘤發(fā)生時，腫瘤細胞中miR-32-5p 表達降低，導致KLF4 的表達升高，而KLF4促進細胞周期相關癌基因如周期素D1等的表達，導致腫瘤細胞增殖及轉移能力增強［19］。

表1 結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2表達與患者臨床病理特征的關系

EZH2 作為多梳蛋白家族成員之一，在胚胎發(fā)育的早期能夠調控細胞的增殖及分化功能［20］。近年來有學者發(fā)現(xiàn)，EZH2 基因的持續(xù)激活能夠促進細胞的惡性增殖及轉化，可能是腫瘤重要的致癌基因。機制上，EZH2 參與構成組蛋白甲基轉移酶，促進組蛋白賴氨酸甲基化，抑制多種P53 等抑癌基因的表達，促進腫瘤的進展［21］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中EZH2 表達上調，這可能與miRNA 對EZH2 的轉錄后調控有關。WANG 等［22］研究表明，結腸癌發(fā)生時抑制EZH2 表達的miRNA 如miR-600 表達降低，引起腫瘤中EZH2 的表達升高。此外，結腸癌中EZH2 的表達與腫瘤分期有關。可能原因是腫瘤發(fā)生時EZH2 的表達升高，引起組蛋白去乙?；傅幕钚越档汀53基因H3K27位點的甲基化水平增加，導致P53 基因的G2/M 期周期阻滯功能喪失、腫瘤細胞的增殖及浸潤能力提高［23］。

本研究進一步分析結腸癌中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達的相關性，結果顯示ln?cRNA XIST 與 miR-32-5p 的表達呈負相關，miR-32-5p 與EZH2 的表達呈負相關，其機制可能是lncRNA XIST 能夠作為分子海綿結合并抑制miR-32-5p 的表達，導致miR-32-5p 水平降低，而miR-32-5p 能夠特異性結合并抑制EZH2的表達，即lncRNA XIST 能夠通過miR-32-5p/EZH2 分子軸促進結腸癌腫瘤細胞的增殖及遷移［9］。

綜上所述，結腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 與EZH2表達上調，而miR-32-5p 表達下調，癌組織中l(wèi)n?cRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表達與腫瘤分期有關，lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 三者共同參與結腸癌的惡性進展。但三者的具體作用機制及臨床應用價值仍需深入研究。