張鳳，羅德蘭，鐘玉全

內(nèi)江市第一人民醫(yī)院，四川內(nèi)江641000

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是免疫相關(guān)的慢性非特異性腸道炎性病變，近年來(lái)隨著我國(guó)人民生活水平的提高，發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢(shì)［1］。病因尚不明確，與遺傳、環(huán)境及免疫等因素有關(guān)，表現(xiàn)為腸黏膜組織損傷及機(jī)體免疫功能紊亂［2］。目前UC的治療主要包括激素治療、手術(shù)治療等，但部分UC患者存在激素治療不敏感或激素抵抗的現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失?。?］。因此，研究炎癥性腸?。↖BD）的病因及發(fā)病機(jī)制，尋找UC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，對(duì)于控制UC患者癥狀發(fā)作、盡早應(yīng)用免疫抑制劑轉(zhuǎn)換治療及提高患者生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的RNA分子，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及衰老等生理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在炎癥、免疫、腫瘤等多種疾病中均存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，通過(guò)調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［4］。miR-155基因位于人類(lèi)染色體21q12.3，是一種參與造血、炎癥和免疫反應(yīng)的多功能miRNA，其表達(dá)受炎癥因子和toll樣受體配體誘導(dǎo)［5］。研究表明，在IBD患者結(jié)腸黏膜中miR-155的表達(dá)異常升高，并通過(guò)調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子Est-1，促進(jìn)UC的發(fā)生發(fā)展［6］。但目前UC患者血清中miR-155表達(dá)及臨床意義報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)UC患者血清中的miR-155，分析其與UC病情嚴(yán)重程度及復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2017年12月我院診治的97 例UC 患者（UC 組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)IBD 學(xué)組制定的《炎性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》中UC 診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷［7］；臨床及隨訪資料完整；既往無(wú)激素類(lèi)等藥物治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能障礙疾??；患精神障礙性等疾?。换嘉改c道細(xì)菌性、病毒性感染及腸道結(jié)核等腸道疾病。UC 組患者年齡33～56（41.4 ± 5.6）歲；男50 例，女47 例；有吸煙史 57 例，無(wú)吸煙史40 例；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18.2～27.4（21.3 ± 3.4）kg/m2；病情活動(dòng)期 61 例，緩解期36例；病變范圍：直腸及乙狀結(jié)腸41例，左半結(jié)腸34例，全結(jié)腸22 例；伴腸外癥狀（包括關(guān)節(jié)疼痛、口腔病變等）28 例，無(wú)腸外癥狀69 例。以49 例查體健康人群作為對(duì)照組，其中男27 例，女22 例；年齡35～59（43.1 ± 6.1）歲；BMI 18.7～28.1（21.7 ± 4.1）kg/m2。UC組與對(duì)照組性別、年齡及BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 血清中miR-155 表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR。留取各組清晨空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，4 ℃下2 500 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），將上清移至EP 管中，-70 ℃保存待測(cè)。應(yīng)用TRIzol 法提取血清中總RNA，溶于DEPC 水中，Narodrop 檢測(cè)總 RNA 的濃度及純度，OD260/OD280介于 1.8～2.0。以總RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。總反應(yīng)體系包括模板1μL cD?NA、0.2 μL Taq 聚合酶、1 μL 上游及下游引物、10μL 2×SYBR Green mix 和 1 μL 20 mmol/L dNTPs，ddH2O 補(bǔ)足 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 60 s，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，變性退火延伸共40 個(gè)循環(huán)。miR-155 正向引物序列：5"-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3"，反向引物序列：5"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3"；內(nèi)參基因 U6正向序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向序列 ：3"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-5"。 采 用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用速率散射比濁法檢測(cè)外周血的C 反應(yīng)蛋白（CRP），應(yīng)用魏氏法檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率（ESR）。

1.3 UC 內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)及臨床活動(dòng)度評(píng)價(jià) 采用UC 內(nèi)鏡下嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分（UCEIS 評(píng)分）對(duì)受累腸段嚴(yán)重程度評(píng)分［8］，評(píng)分內(nèi)容包括血管紋路（0～2 分）、出血情況（0～3 分）及糜爛潰瘍（0～3分），評(píng)分越高，受累腸段病情越重。UC 緩解期UCEIS 評(píng)分 0～1 分，活動(dòng)期 2～8 分。UC 臨床活動(dòng)度采用 Mayo 評(píng)分評(píng)價(jià)［9］，癥狀緩解為 0～2 分、輕度活動(dòng)為3～5 分、中度活動(dòng)為6～10 分、重度活動(dòng)為11～12分。

1.4 隨訪 所有患者出院后以門(mén)診或電話方式隨訪，每月隨訪1次，隨訪2年，隨訪內(nèi)容為患者復(fù)發(fā)情況，復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)參考《炎性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》中關(guān)于UC 的診斷內(nèi)容。隨訪截止至2019 年12月。隨訪終點(diǎn)為患者復(fù)發(fā)或隨訪結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用F檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 線性相關(guān)分析miR-155 與UCEIS 評(píng)分及Mayo 評(píng)分的相關(guān)性。采用多因素Logistic回歸分析UC患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-155 表達(dá)比較 對(duì)照組與UC 組miR-155 相對(duì)表達(dá)量分別為 0.35 ± 0.07、1.95 ±0.36，兩組比較P<0.01。

2.2 UC 不同臨床活動(dòng)度患者血清miR-155、Mayo評(píng)分及UCEIS 評(píng)分比較 UC 緩解期、UC 活動(dòng)期患者 miR-155 相對(duì)表達(dá)量分別為 1.67 ± 0.36、2.12 ±0.41，兩組比較P<0.01。UC 不同臨床活動(dòng)度患者血清miR-155、Mayo 評(píng)分及UCEIS 評(píng)分比較見(jiàn)表1。Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，UC 活動(dòng)期患者血清 miR-155 與 Mayo 評(píng)分及 UCEIS 評(píng)分呈正相關(guān)（r分別為0.512、0.603，P均<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 UC不同臨床活動(dòng)度患者血清miR-155表達(dá)、Mayo評(píng)分及Baron評(píng)分比較（±s）

表1 UC不同臨床活動(dòng)度患者血清miR-155表達(dá)、Mayo評(píng)分及Baron評(píng)分比較（±s）

注：與輕度相比，＊P<0.05；與中度相比，#P<0.05。

臨床活動(dòng)度輕度中度重度F P n 19 22 20 miR-155相對(duì)表達(dá)量1.85±0.46 2.11±0.44＊2.39±0.38＊#7.671<0.01 Mayo評(píng)分（分）3.46±0.71 5.22±0.94＊8.76± 1.25＊#145.002<0.01 UCEIS評(píng)分（分）3.49±0.81 4.22±0.90＊5.96± 1.10＊#11.793<0.01

2.3 血清miR-155 與UC 復(fù)發(fā)的關(guān)系 隨訪過(guò)程中，UC 組 97 例患者中無(wú)復(fù)發(fā) 48 例、復(fù)發(fā) 49 例，復(fù)發(fā)率50.5%（49/97）。UC 患者復(fù)發(fā)與腸外表現(xiàn)、血清miR-155、ESR 及 CRP 有關(guān)（P均<0.05），而與性別、年齡、BMI、吸煙史及病變位置無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 影響UC患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素單因素分析

將腸外表現(xiàn)、CRP、ESR和miR-155作為自變量，將復(fù)發(fā)與否作為因變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸外表現(xiàn)、CRP、ESR 和 miR-155 是UC患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

3 討論

UC 是病因及發(fā)病機(jī)制不明的胃腸道慢性炎性疾病，屬于IBD的一種類(lèi)型。近年來(lái)我國(guó)UC發(fā)病率有逐漸增加的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康。目前UC 尚缺乏特異性的診斷指標(biāo)，易將感染性結(jié)腸炎、克羅恩病等誤診為UC，并且UC 病程較長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高，腸道長(zhǎng)期慢性炎癥有腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［10］。因此，深入研究UC 疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有效診斷評(píng)估UC 病情程度的血清學(xué)指標(biāo)，探討UC 復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，對(duì)于評(píng)估IBD 患者病情及預(yù)后具有重要的臨床意義。miRNA 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的小的非編碼RNA 分子，以往認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“分子垃圾”，但大量研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥、免疫及腫瘤等多種病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［11］。檢測(cè)患者外周血中miRNA 水平變化有助于疾病的早期診斷、治療及隨訪，是一種有潛在價(jià)值的血清標(biāo)志物［12］。

表3 影響UC患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素多因素Logistic回歸分析

miR-155 是一種多功能的microRNA，最初發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)功能，在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［13］。研究表明，miR-155對(duì)IBD的發(fā)生發(fā)展也至關(guān)重要，在UC 腸黏膜組織中過(guò)表達(dá)，并能夠通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，下調(diào)E-鈣黏素的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致UC 的發(fā)生［14］。本研究中，UC患者血清miR-155 表達(dá)高于對(duì)照組。目前其機(jī)制尚不清楚，可能與腸道局部炎癥環(huán)境中免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子失調(diào)有關(guān)。研究表明，炎癥微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等能產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，如 TNF-α，TNF-α 能夠激活核因子κB 信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于miR-155啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR-155表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引起UC 的發(fā)生［15］。此外本研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者血清miR-155 表達(dá)與疾病的活動(dòng)性有關(guān)，活動(dòng)期患者血清miR-155 表達(dá)高于緩解期，并且miR-155與反映活動(dòng)期病情程度的Mayo評(píng)分及UCEIS評(píng)分呈正相關(guān)。表明miR-155 參與UC 的發(fā)生發(fā)展，有可能成為判斷UC 活動(dòng)期病情嚴(yán)重程度的血清標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 表達(dá)上調(diào)后能夠抑制IL-6、IL-8 等抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重炎癥微環(huán)境中促炎及抗炎平衡系統(tǒng)的失調(diào)，導(dǎo)致UC 疾病進(jìn)展［16］。此外，miR-155 通過(guò)影響靶基因的表達(dá)，影響多種免疫細(xì)胞的功能，如miR-155能夠結(jié)合并抑制Jarid2基因的表達(dá)，引起Th17 細(xì)胞中notch1 信號(hào)通路的過(guò)度活化，產(chǎn)生大量IL-17細(xì)胞因子，IL-17招募大量中性粒細(xì)胞進(jìn)入局部組織，從而加重UC 腸壁組織損傷［17］。本研究對(duì) UC 組 97 例患者隨訪 2 年，49 例患者復(fù)發(fā)。進(jìn)一步采用單因素及多因素Logistic 回歸分析影響UC復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，發(fā)現(xiàn)腸外表現(xiàn)、CRP、ESR 和miR-155 是UC 患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。血清高miR-155 表達(dá)患者UC 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高于低表達(dá)者，與miR-155 參與UC 的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程有關(guān)?？赡苁茄甯適iR-155 表達(dá)的UC 患者由于腸壁病變較重，腸黏膜愈合時(shí)間長(zhǎng)，腸黏膜上皮屏障功能障礙，加上腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的抗菌因子減少導(dǎo)致殺菌屏障功能不足，導(dǎo)致腸道細(xì)菌易突破腸道屏障，引起UC復(fù)發(fā)［18］。CRP 和 ESR 是 UC 診斷及治療中常用的生物學(xué)指標(biāo)，與UC 病情活動(dòng)有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)兩者是UC 復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素?？赡苁菣C(jī)體炎癥介質(zhì)如IL-1、TNF-α 等水平升高促進(jìn)肝臟合成CRP 合成，因而CRP水平越高的UC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高。此外，血清中某些蛋白成分改變及紅細(xì)胞壓積的變化常引起ESR 上升，ESR 較高反映機(jī)體仍處于炎癥狀態(tài)，增加UC 復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。UC 病變以腸道為主，但同時(shí)可伴有關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍等腸外表現(xiàn)，本研究中伴有腸外表現(xiàn)的患者UC 復(fù)發(fā)率較高。其原因可能是UC 腸外表現(xiàn)與腸道的炎癥程度密切相關(guān)，腸道炎癥程度越重，腸外表現(xiàn)的發(fā)生率越高，增加UC復(fù)發(fā)［19］。

綜上所述，UC 患者血清miR-155 表達(dá)高，miR-155與IBD疾病活動(dòng)性及活動(dòng)期嚴(yán)重程度有關(guān)，血清高miR-155 表達(dá)是UC 疾病復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。miR-155 有可能成為反映UC 患者病情及判斷預(yù)后的血清標(biāo)志物，具有一定的臨床價(jià)值。