王浩 ，郭豐富

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000；2 臨沂市人民醫(yī)院

膀胱癌（BC）是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，病理類型以膀胱移行細(xì)胞癌最常見(jiàn)。全球每年BC 新發(fā)病例數(shù)達(dá)40萬(wàn)，并且其發(fā)病率及病死率有逐漸上升的趨勢(shì)［1］。目前BC 治療包括根治手術(shù)治療、放化療及免疫治療等，但由于腫瘤異質(zhì)性較大，患者術(shù)后易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命［2］。因而，有必要研究BC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的BC的腫瘤標(biāo)志物。微小RNA（miRNA）是細(xì)胞內(nèi)無(wú)蛋白編碼功能的具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA 分子，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，其參與構(gòu)成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物結(jié)合靶基因mRNA 的3"非編碼區(qū)，促進(jìn)靶基因mRNA的降解，從而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與胚胎發(fā)育、增殖、凋亡、代謝及腫瘤發(fā)生等病理生理過(guò)程［3］。miR-130a-3p 基因位于11q12.1，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因如c-Met 的mRNA，抑制c-Met的翻譯，發(fā)揮抑癌基因的作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p 在腎細(xì)胞癌［4］、乳腺癌［5］及鼻咽癌［6］等腫瘤中表達(dá)降低，并促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移能力。睪丸蛋白聚糖（SPOCK1）基因位于5q31.2，編碼血漿蛋白聚糖的蛋白核心，參與構(gòu)成硫酸軟骨素和乙酰肝素的肽鏈，功能上發(fā)揮半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用。近年來(lái)研究表明，前列腺癌［7］、肺癌［8］等多種腫瘤中SPOCK1 的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)能力增強(qiáng)。有學(xué)者在肺腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549 中發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p的表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制SPOCK1 的表達(dá)，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及遷移能力［9］。因此，miR-130a-3p 與SPOCK1 可能是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。本研究通過(guò)檢測(cè)BC 組織中miR-130a-3p、SPOCK1的表達(dá)，初步探討兩者的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年10月—2020年6月在我院診治的BC 患者94 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診治；經(jīng)病理活檢診斷為BC；以往無(wú)其他惡性腫瘤病史，無(wú)放化療及靶向治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有神經(jīng)源性膀胱、膀胱攣縮等疾??；合并嚴(yán)重泌尿生殖系統(tǒng)感染或膀胱結(jié)核感染；合并精神障礙性疾病，不能配合治療。其中男 55 例、女 39 例；年齡 32～78（46.6 ±6.1）歲；病理分級(jí)：高級(jí)別 38 例，中低級(jí)別56 例；病理類型：移行細(xì)胞癌85 例，非移行細(xì)胞癌9 例，其中鱗癌4 例，腺癌5 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期32例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，不合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61 例；合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14 例，不合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移80例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，且患者均知情同意并簽字。

1.2 組織中miR-130a-3p、SPOCK1 表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR。取BC腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm 以上，經(jīng)病理檢查明確為正常膀胱黏膜組織）10 mg，應(yīng)用總RNA 提取試劑盒（北京天根公司）提取組織中總RNA，Narodrop 檢測(cè)總RNA 的濃度和純度，OD260/OD280介于1.8～2.1。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-130a-3p 熒光定量 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 4 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系：2×SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。SPOCK1 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系：2×SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。miR-130a-3p以U6為內(nèi)參，U6正向序列：5"-AAAGTGGCTAAACGAAGCTGAA-3′，反向序列：5"-GTGGGCAGTGGGTTCTTCTC-3"。SPOCK1 以GAPDH 為內(nèi)參，正向序列：5"-CTGGGCTACACT?GAGCACC-3"，反 向 序 列 ：5"-AAGTGGTCGTT?GAGGGCAATG-3"。 采 用 2-ΔΔCt法計(jì) 算 組織 中 miR-130a-3p、SPOCK1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-130a-3p 與SPOCK1 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用 TargetScan Human7.2 在線軟件（http：//www.tar?getscan.org/vert_72/）對(duì)miR-130a-3p與SPOCK1的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示miR-130a-3p 與SPOCK1 存在潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-130a-3p與SPOCK1的結(jié)合位點(diǎn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)；miR-130a-3p 與 SPOCK1 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性用Pearson 相關(guān)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BC 癌組織及癌旁組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 表達(dá)比較 BC 癌及癌旁組織中miR-130a-3p 的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.448 ± 0.107、1.120 ±0.208，SPOCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.763±0.315、0.370± 0.083，兩者相比P均<0.05。

2.2 BC 癌組織中 miR-130a-3p 與 SPOCK1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 BC 癌組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.621，P<0.05）。

2.3 BC 癌組織中 miR-130a-3p、SPOCK1 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

3 討論

BC是常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)的腫瘤，世界上每年新發(fā)病例達(dá) 35.6 萬(wàn)例，死亡例數(shù)達(dá) 14.5 萬(wàn)例［10］。BC常見(jiàn)的病理類型有膀胱移行細(xì)胞癌、鱗癌及腺癌等，其中以膀胱移行細(xì)胞癌較為常見(jiàn)。目前BC的治療包括手術(shù)治療、放化療及生物治療等，但高級(jí)別高分期的患者預(yù)后不佳，長(zhǎng)期生存時(shí)間較短［11］。因此，深入研究BC的發(fā)病機(jī)制，對(duì)臨床診斷及治療具有重要的意義。BC疾病的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，與遺傳因素、環(huán)境因素有關(guān)，涉及多種癌基因的激活及抑癌基因的失活。近年來(lái)大量研究表明，細(xì)胞內(nèi)存在的非編碼RNA 分子如miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA 及環(huán)狀RNA 等，能夠在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)，影響正常細(xì)胞的分化、發(fā)育等生理過(guò)程，并參與腫瘤、自身免疫及感染等疾病的發(fā)生發(fā)展［12］。

表1 BC癌組織中miR-130a-3p、SPOCK1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

miRNA 是真核生物細(xì)胞內(nèi)的小RNA 分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明，腫瘤中存在miR-122、miR-221等多種miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象，如miR-221 表達(dá)升高能夠直接抑制細(xì)胞周期素激酶抑制劑p57的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的G1期向S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［13］。miR-130 家族包括 miR-130a-3p、miR-130b-3p、miR-301a-3p 等，具有共同的編碼基因序列。miR-130a-3p 作為miR-130家族成員，在乳腺癌、BC等腫瘤中存在異常表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，可通過(guò)激活磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信號(hào)通路的活化，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［5，14］。本研究中BC患者癌組織中miR-130a-3p的相對(duì)表達(dá)量降低，其機(jī)制可能與長(zhǎng)鏈非編碼RNA 的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR可以作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-130a-3p 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致下游缺氧誘導(dǎo)因子1A 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展［15］。此外，癌組織中miR-130a-3p的表達(dá)與腫瘤TNM 分期有關(guān)，高分期癌組織中miR-130a-3p 表達(dá)較低，表明miR-130a-3p 的低表達(dá)促進(jìn)BC 的惡性進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道，miR-130a-3p 能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞表面間質(zhì)性表型如N-鈣黏素、Vimentin表達(dá)增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易發(fā)生局部浸潤(rùn)，引起腫瘤分期升高［16］。

SPOCK1 又稱為Testican-1，是一種細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白聚糖，屬于鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族成員，其能夠影響細(xì)胞的發(fā)育分化及增殖等生物學(xué)行為，參與細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用［17］。研究表明，SPOCK1 在非小細(xì)胞肺癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)升高，高表達(dá)SPOCK1 的腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力顯著增強(qiáng)，并促進(jìn)患者腫瘤的惡性進(jìn)展［9，18］。本研究中，BC 癌組織中 SPOCK1 mRNA 的表達(dá)升高，可能與miRNA 對(duì)SPOCK1 的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-139 能夠直接結(jié)合SPOCK1 mRNA 的 3"非編碼區(qū)，導(dǎo)致 SPOCK1 mRNA的穩(wěn)定性降低，抑制SPOCK1 的表達(dá)，而腫瘤發(fā)生時(shí)miR-139 表達(dá)水平降低，導(dǎo)致 SPOCK1 表達(dá)升高［18］。BC 癌組織中 SPOCK1 mRNA 的表達(dá)與腫瘤 TNM 分期有關(guān)，提示SPOCK1 可能作為一種癌基因促進(jìn)BC的發(fā)生發(fā)展。研究表明，SPOCK1 是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞容易與細(xì)胞外基質(zhì)分離，腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)的侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤分期升高［19］。

本研究Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，BC 癌組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，miR-130a-3p 與SPOCK1存在潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miR-130a-3p 可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控SPOCK1 mRNA 的表達(dá)，發(fā)揮抑癌的生物學(xué)功能。有學(xué)者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，miR-130a-3p 可直接結(jié)合到SPOCK1 mRNA 的3"非編碼區(qū)，降低SPOCK1 mRNA 的穩(wěn)定性，抑制SPOCK1 的表達(dá)，而腫瘤中miR-130a-3p 的表達(dá)降低則導(dǎo)致SPOCK1 表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［20］。但BC中miR-130a-3p對(duì)SPOCK1表達(dá)調(diào)控的機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，BC 癌組織中miR-130a-3p表達(dá)下調(diào)，而 SPOCK1 表達(dá)上調(diào)。miR-130a-3p、SPOCK1 的表達(dá)與腫瘤TNM 分期有關(guān)，有可能作為新的BC 診斷及治療的腫瘤標(biāo)志物。但BC中miR-130a-3p是否直接通過(guò)影響SPOCK1 的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，進(jìn)而影響B(tài)C的惡性進(jìn)展，有待深入的實(shí)驗(yàn)研究。