張文文 李恭馳 鄒利軍 馮自波 杜 燁 胡映月 鄧海波 祝友鵬 潘銀根 李炳輝

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科，湖北 武漢 430077；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院手外科，湖北 武漢 430022；3.江蘇省啟東市人民醫(yī)院整形美容科，江蘇 啟東 226200）

慢性創(chuàng)面是一個世界性健康問題，以糖尿病性潰瘍?yōu)槔?，因?chuàng)面反復(fù)感染不愈合或者糖尿病性并發(fā)癥造成截肢等嚴重后果,給全世界造成了巨大的經(jīng)濟負擔[1]。皮膚損傷修復(fù)包括炎癥期、組織形成期、組織重塑期，3個階段相互關(guān)聯(lián)和重疊[2]，并且涉及到多種細胞因子的作用，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在早期炎癥反應(yīng)階段起著重要作用。細胞外基質(zhì)為組織結(jié)構(gòu)提供了支持，并且通過大量信號分子來調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)，因而在傷口愈合過程中至關(guān)重要。皮膚損傷修復(fù)需要真皮層或者促進真皮層生成的結(jié)構(gòu)。脫細胞真皮基質(zhì)（ADM）一直被用作軟組織替代品用于傷口愈合、組織修復(fù)和重建領(lǐng)域[3]。ADM是自體或異種皮膚去除細胞成分而得，它保留了不可溶的分子（如彈性蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白）[4]。豬脫細胞真皮基質(zhì)（pADM）為三維膠原基質(zhì)，是一種常用的生物材料，具有促進創(chuàng)面愈合的作用[5]。毛囊是一個復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，含有能夠再生表皮及皮膚附屬器的干細胞[6]。Wnt信號通路在毛囊生長循環(huán)中起著十分重要的作用，是毛囊形態(tài)發(fā)生過程中的主要調(diào)控因子，Wnt3a及β-catenin是Wnt信號通路中經(jīng)典的兩個蛋白信號分子[7]。本研究中探討了pADM作為一種細胞外基質(zhì)，在創(chuàng)面愈合過程中對創(chuàng)面組織TNF-α蛋白表達的影響，以及二者對毛囊角質(zhì)細胞中Wnt3a及β-catenin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 10周齡雄性C57BL/6小鼠12只，SPF級，體重20～25 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，分籠自由進食和飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠毛囊角質(zhì)細胞（購自中國賽百慷生物有限公司），TNF-α（購自Peprotech公司），TNF-α抑制劑依那西普（三生國健藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），細胞角蛋白14（CK14）抗體、TNF-α抗體、β-catenin抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（購自Abcam公司），Wnt3a抗體（購自Affinity公司），pADM(購自江蘇優(yōu)創(chuàng)生物醫(yī)學科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠慢性創(chuàng)面模型建立及取材 小鼠皮膚慢性創(chuàng)面模型的復(fù)制方法參考文獻[8]的方法：在小鼠背部兩側(cè)用皮膚取樣器制作直徑8 mm全層皮膚缺損模型，用帶有窗口的8 mm硅膠套環(huán)與創(chuàng)面皮緣縫合，分別使用紗布（紗布組）和pADM（pADM組）覆蓋創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面愈合情況，并于第7、14、21天取從硅膠套環(huán)窗口處爬行的新生皮膚組織，采用免疫組化法檢測皮膚組織中TNF-α、Wnt3a和β-catenin的蛋白表達水平。

1.2.2 免疫組化法檢測創(chuàng)面組織TNF-α、Wnt3a和β-catenin的蛋白表達 獲取的創(chuàng)面組織固定于4%多聚甲醛中制作石蠟切片，置于65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，用PBS洗3次，每次5 min。切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，再置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min。PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封閉20 min。加入適量兔抗鼠一抗 TNF-α(1:100)、Wnt3a(1:100)、β-catenin(1:200)覆蓋組織，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，加適量相應(yīng)種屬辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（1:200），37 ℃孵育50 min，PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，加新鮮配制3,3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化（約1 s），自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗；梯度乙醇（75%、90%、100%、100%，各10 min）脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，利用圖像分析軟件測量圖片染色程度，以積分吸光度（A值）反映蛋白表達量。

1.2.3 大鼠毛囊角質(zhì)細胞培養(yǎng)及細胞免疫熒光鑒定 大鼠毛囊角質(zhì)細胞培養(yǎng)于iCell原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下恒溫無菌培養(yǎng)，無菌超凈臺內(nèi)制作細胞爬片，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min。10%山羊血清室溫封閉2 h，棄封閉液，滴加適量兔抗大鼠一抗CK14，4 ℃孵育過夜。次日滴加與一抗種屬對應(yīng)的山羊抗兔二抗,避光室溫孵育1 h,棄二抗，PBS清洗5 min，洗3次，稍甩干后滴加適量4"6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液到爬片上，室溫避光孵育15 min。PBS漂洗爬片3次，每次5 min，取出爬片滴加抗熒光淬滅封片劑于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 體外實驗分組 取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的大鼠毛囊角質(zhì)細胞接種于6孔板中，接種密度為1×106個/ml。將細胞分為6組：對照組（單純大鼠毛囊角質(zhì)細胞）、pADM組（大鼠毛囊角質(zhì)細胞+pADM 20 μg/ml）、TNF-α組（大鼠毛囊角質(zhì)細胞+10 ng/ml TNF-α）、TNF-α抑制劑組（大鼠毛囊角質(zhì)細胞+TNF-α抑制劑依那西普10 μmol/L）、TNF-α+pADM組（大鼠毛囊角質(zhì)細胞+10 ng/ml TNF-α+pADM 20 μg/ml）、TNF-α 抑制劑 +pADM 組（ 大鼠毛囊角質(zhì)細胞+TNF-α抑制劑10 μmol/L+pADM 20 μg/ml）。各組在 37 ℃、5%CO2條件下恒溫無菌培養(yǎng)48 h后，提取細胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測大鼠毛囊角質(zhì)細胞中Wnt3a和β-catenin蛋白的表達量。

1.2.5 Western Blot檢測體外大鼠毛囊角質(zhì)細胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表達 提取細胞總蛋白，適量RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1）超聲破碎至裂解完全。4 ℃，12 000 r/min離心20 min,取上清，BCA測定濃度后，剩余上清加入5倍上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴10 min。配電泳膠，取30 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，牛奶封閉2 h，洗膜后4 ℃孵育一抗過夜，次日TBST洗膜10 min,洗3次，加入與兔抗大鼠一抗種屬對應(yīng)的HRP標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL曝光顯影，Image J軟件測量條帶灰度值進行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用方差分析和組間兩兩比較配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型小鼠創(chuàng)面窗愈合情況 小鼠背部皮膚造模后第7天，pADM組與紗布組均在環(huán)形硅膠窗口處可見粉紅色新生上皮組織，并隨著時間延長，創(chuàng)面逐漸縮小，pADM組小鼠皮膚創(chuàng)面在第21天基本愈合，愈合速度比紗布組快，這一觀察結(jié)果與我團隊前期研究結(jié)果相同[8-9]。

2.2 大鼠創(chuàng)面修復(fù)過程中新生皮膚組織TNF-α、Wnt3a和β-catenin的蛋白表達 免疫組化結(jié)果顯示，在不同時間點，pADM組創(chuàng)面組織中TNF-α、Wnt3a和β-catenin的表達差異均有統(tǒng)計學意義（FTNF-α=18.06，P=0.002 9；FWnt3a=18.26，P=0.002 8；Fβ-catenin=22.18，P=0.001 7）。兩組間比較，pADM組TNF-α表達量于傷后7、14 d明顯高于紗布組（P＜0.01），傷后21 d則明顯低于紗布組（P＜0.01）。pADM組中Wnt3a在第7天表達上調(diào)且表達量最高，與紗布組比較差異有統(tǒng)計學意義（t7=7.297，P=0.001 9）,在第14天和21天與紗布組差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。pADM組中β-catenin在第14天和21天表達上調(diào)，在第21天表達量最高，與紗布組比較差異均有統(tǒng)計學意義（t14=8.633，P=0.001 0；t21=7.657，P=0.001 6）,但在第7天與紗布組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 體外實驗中大鼠毛囊角質(zhì)細胞鑒定 細胞在顯微鏡下大多呈梭型，貼壁生長，有觸角。見圖1（封二）。

2.4 體外實驗中pADM、TNF-α對大鼠毛囊角質(zhì)細胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表達的影響 Western Blot結(jié)果顯示：與對照組相比，pADM上調(diào)Wnt3a、β-catenin蛋白的表達（tWnt3a=13.43，P=0.000 2；tβ-catenin=13.43，P=0.000 2），TNF-α下調(diào)Wnt3a、β-catenin蛋 白 的 表 達（tWnt3a=6.926,P=0.002 3；tβ-catenin=6.926，P=0.002 3）；TNF-α 抑 制 劑 組Wnt3a、β-catenin表 達 上 調(diào)（tWnt3a=11.20，P=0.000 4；tβ-catenin=11.20，P=0.000 4），TNF-α+pADM組表達水平上調(diào)（tWnt3a=10.31，P=0.000 5；tβ-catenin=10.31，P=0.000 5），TNF-α抑制劑+pADM組表達水平上調(diào)（tWnt3a=10.71，P=0.000 4；tβ-catenin=10.71，P=0.000 4），差異均有統(tǒng)計學意義。pADM組與TNF-α抑制劑組均上調(diào)Wnt3a和β-catenin的表達，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（tWnt3a=7.744，P=0.001 5；tβ-catenin=7.744，P=0.001 5），pADM組Wnt3a、β-catenin表達水平上調(diào)更高。TNF-α抑制劑組與TNF-α抑制劑+pADM組Wnt3a、β-catenin表達水平均上調(diào)，且TNF-α抑制劑+pADM組上調(diào)水平更高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（tWnt3a=7.629，P=0.001 6；tβ-catenin=7.629，P=0.001 6）。與TNF-α組比，TNF-α抑制劑組Wnt3a、β-catenin表達上調(diào)（tWnt3a=45.40，P〈0.000 1；tβ-catenin=45.40，P〈0.000 1）,TNF-α+pADM組Wnt3a、β-catenin表達上調(diào)（tWnt3a=47.74，P〈0.000 1；tβ-catenin=47.74，P〈0.000 1），TNF-α抑制劑+pADM組Wnt3a、β-catenin表達上調(diào)（tWnt3a=13.33，P=0.000 2；tβ-catenin=13.33，P=0.000 2），差異均有統(tǒng)計學意義。見圖2和圖3。

表1 創(chuàng)面修復(fù)不同時間新生皮膚組織中各蛋白表達的變化

表1 創(chuàng)面修復(fù)不同時間新生皮膚組織中各蛋白表達的變化

組別 TNF-α傷后7 d 傷后14 d 傷后21 d pADM組 2 248.82±305.185 694.14±1 105.532 993.23±567.73紗布組 676.71±121.64 131.34±21.900 4 522.09±696.74 t值 8.288 8.714 8.595 P值 0.001 2 0.001 0 0.001 0組別 Wnt3a傷后7 d 傷后14 d 傷后21 d pADM組 7 931.02±1 196.473 449.21±672.13 5 840.67±771.62紗布組 2 538.64±454.67 3 343.98±649.26 4 522.09±696.74 t值 7.297 0.1950 2.197 P值 0.001 9 0.854 9 0.093 0組別 β-catenin傷后7 d 傷后14 d 傷后21 d pADM組 3 646.32±687.04 8 447.29±1 181.799 488.65±1 439.52紗布組 4 364.09±811.29 2 187.85±424.84 02 752.27±500.00 t值 1.169 8.633 7.657 P值 0.307 2 0.001 0 0.001 6

圖2 Western Blot檢測各組大鼠毛囊角質(zhì)細胞Wnt3a和β-catenin蛋白水平的變化

圖3 各毛囊角質(zhì)細胞干預(yù)組中Wnt3a和β-catenin蛋白表達水平的比較

3 討 論

皮膚由表皮、真皮、皮下組織構(gòu)成，并含有皮膚附屬器官，皮膚附屬器官包括毛囊和皮脂腺等。皮膚損傷時，皮膚干細胞可以再生表皮及附屬物，毛囊干細胞在創(chuàng)面修復(fù)中亦發(fā)揮著重要作用，毛囊干細胞被證明可以動員到毛囊上部，在皮膚損傷后向傷口遷移達到表皮，分化為表皮細胞，促進再上皮化[10]。研究表明，皮膚損傷后，在早期炎癥反正過程中必不可少的巨噬細胞通過分泌TNF-α激活毛囊干細胞，TNF-α的增加激活了β-catenin并增加了Wnt3a的表達[11]。有研究表明，生物材料與合成材料相比，可使創(chuàng)面抗炎細胞因子釋放增加，細菌清除效率改善，并改善了愈合效果[6，12]。

pADM是治療慢性創(chuàng)面最常用的生物材料，它起支架作用，并可能提供促進增殖、細胞附著、遷移等的信號分子[13]。本研究中pADM組比紗布組創(chuàng)面縮小的速度快，且pADM組在傷后第21天創(chuàng)面基本愈合。另外， pADM組與紗布組相比，TNF-α表達上調(diào)，在第7天Wnt3a表達上調(diào)最高，β-catenin在第14、21天表達上調(diào)并在第21天上調(diào)達到最高，但β-catenin上調(diào)的時間比Wnt3a遲了1周的具體機制有待進一步研究。

毛囊干細胞只有在創(chuàng)傷后才遷移到表皮[14]，說明創(chuàng)傷是導(dǎo)致毛囊中干細胞遷移到表皮，從而分化為表皮細胞，促進再上皮化的重要原因[15]。TNF基因敲除和過表達均可以抑制創(chuàng)面毛囊新生，提示TNF-α在毛囊新生中的作用可能有更復(fù)雜的機制[10]。毛囊細胞中表達TNFR1和TNFR2兩種受體，除了參與TNF-α激活毛囊以外，也可能跟參與毛囊生長周期中毛囊細胞凋亡有關(guān)系[10]。在體外實驗中，與對照組相比，加入TNF-α+pADM后， Wnt3a及β-catenin表達上調(diào)，且單純加入pADM后，上調(diào)Wnt3a及β-catenin，加入TNF-α抑制劑和pADM后，Wnt3a和β-catenin表達量最高，但是TNF-α+pADM與TNF-α抑制劑組無明顯差別，表明pADM作為一種細胞外基質(zhì)，可能通過調(diào)節(jié)TNF-α進而影響Wnt3a和β-catenin的表達。但本研究中體外實驗顯示加入TNF-α后，Wnt3a及β-catenin表達下降，與體內(nèi)pADM組TNF-α上調(diào)不一致，表明體內(nèi)調(diào)控機制復(fù)雜，有待進一步研究。

Wnt信號可促進細胞增殖、分化、細胞遷移和細胞黏附。本研究結(jié)果顯示，pADM可以上調(diào)毛囊角質(zhì)細胞中Wnt3a和β-catenin的表達，pADM作為組織工程中很重要的天然生物材料，可以通過上調(diào)TNF-α、Wnt3a、β-catenin的表達從而促進創(chuàng)面損傷的修復(fù)，為包括糖尿病性潰瘍等慢性創(chuàng)面這一重要的臨床問題提出潛在的臨床治療策略。