閔繼斌，葉先才，王志堅(jiān)，劉勝兵

（1.嘉善縣中醫(yī)院，浙江 嘉興 314100；2.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314000）

嗎啡及其衍生物是臨床解除疼痛的主要藥物,是臨床應(yīng)用廣泛的鎮(zhèn)痛藥，長期應(yīng)用嗎啡后其鎮(zhèn)痛效果會(huì)漸弱，出現(xiàn)嗎啡耐受，甚至痛覺過敏。KCC2參與Cl-穩(wěn)態(tài)，成熟神經(jīng)元胞內(nèi)的氯離子外排作用可以使成熟神經(jīng)元胞內(nèi)保持低氯離子濃度，從而使γ成氨基丁酸離子型受體發(fā)揮抑制性作用。KCC2參與各種病因?qū)е碌耐从X過敏，脊髓損傷可以引起神經(jīng)系統(tǒng)KCC2表達(dá)改變[1]。脊髓損傷等可以導(dǎo)致脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞膜的KCC2表達(dá)下調(diào)，引起Cl-在細(xì)胞內(nèi)聚集。研究發(fā)現(xiàn)脊髓KCC2表達(dá)變化與炎性痛或一些病理性疼痛相關(guān)[2-3]。大鼠嗎啡處理后，KCC2在脊髓的表達(dá)可明顯降低?；蛑委熓亲鳛榘邢蛐缘纳锘蛑委煼椒ǎ渚哂休^強(qiáng)的靶向性。用編碼人類神經(jīng)營養(yǎng)因子3腺相關(guān)病毒（AAV-NT3）治療脊髓T9段受傷的大鼠，AAV-NT3基因治療同運(yùn)動(dòng)結(jié)合減緩脊髓損傷后肌肉痙攣[4]。通過在脊髓鞘內(nèi)注射病毒包裝的KCC2，從而在脊髓過表達(dá)KCC2，從而有效緩解神經(jīng)損傷導(dǎo)致的疼痛過敏。脊髓過表達(dá)KCC2后是否對(duì)嗎啡耐受產(chǎn)生影響及相關(guān)機(jī)制尚未有研究[5]。本研究通過大鼠脊髓鞘內(nèi)遞送KCC2，使其在脊髓過表達(dá)，檢測相關(guān)通路蛋白表達(dá)，探討KCC2過表達(dá)延緩嗎啡耐受的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco），invitrogen lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen），苯巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司），嗎啡（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司），250-300g雄性SD大鼠（浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），KCC2抗體、NMDAR抗體和PKC抗體（Cell signaling technology）。

1.2 方法

1.2.1 過表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)染細(xì)胞：構(gòu)建腺病毒載體后，將對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種接種于24孔培養(yǎng)板（細(xì)胞數(shù)為2×104）37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約80%。根據(jù)invitrogen lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明，加入適量質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。6 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察質(zhì)粒上熒光標(biāo)記基因的表達(dá)情況。

1.2.2 腺病毒感染后的表達(dá)檢測：取不同劑量腺病毒原液，加入到HEK293細(xì)胞中，24～48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長情況，收集細(xì)胞、提取蛋白，供western blot檢測實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及脊髓插管模型制備：30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為三組，Ⅰ組為KCC2基因治療組，Ⅱ組為GFP對(duì)照組，Ⅲ組為空白對(duì)照組，每組大鼠為10只。戊巴比妥鈉（4 mg/100g）腹腔注射，待麻醉后固定四肢，消毒頸部去毛后，在兩耳中線下分離肌肉到寰枕后膜，針頭挑破后，見腦脊液。PE-10導(dǎo)管經(jīng)寰枕后膜插入至脊髓腰椎膨大部止，PE-10管體外部分用石蠟封口，防止腦脊液流出。Ⅰ組大鼠鞘內(nèi)注射病毒上清液（108/ml）20μL，Ⅱ組鞘內(nèi)注射control vector20μL，Ⅲ組鞘內(nèi)注射生理鹽水20μL。2周后，各組通過脊髓置管嗎啡，每日2次。嗎啡注射量為15 ug/kg，連續(xù)7 d。

1.2.4 Western檢測脊髓KCC2、NMDAR和PKC表達(dá)：取各組大鼠4只，苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉，冰上迅速分離脊髓，取脊髓L4/5段，超聲破碎脊髓，常規(guī)方法提取組織蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（100 V，120 min），5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育一抗（KCC2）兔抗，4℃過夜，TBST洗一抗（5 min/次，3次），孵育二抗（羊抗兔，37℃，2 h），TBST洗二抗（5 min/次，4次），ECL試劑盒曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，結(jié)果用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察質(zhì)粒上熒光標(biāo)記基因的表達(dá)情況，熒光率大于80%。見圖1，圖2。

圖1 15 ul（100×）

圖2 30 ul（100×）

取不同劑量腺病毒原液，加入到HEK293細(xì)胞中，24～48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長情況，收集細(xì)胞、提取蛋白，western blot檢測。用Flag抗體檢測到130-180KD之間存在特異性條帶，KCC2基因融合蛋白大?。?27 KDa。見圖3。

圖3

KCC2腺病毒包裝KCC2基因鞘內(nèi)注射2周后，western blot檢測，脊髓KCC2表達(dá)明顯升高。見圖4。

圖4

嗎啡處理后，KCC2基因脊髓鞘內(nèi)注射組，western blot檢測，NMDAR表達(dá)下降。見圖5。

圖5

嗎啡處理后，KCC2基因脊髓鞘內(nèi)注射組，western blot檢測PKC表達(dá)下降。見圖6。

圖6

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，通過脊髓鞘內(nèi)注入慢病毒包裝的KCC2，在脊髓過表達(dá)KCC2后，可以恢復(fù)神經(jīng)損傷而影響的Cl-穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)Cl-穩(wěn)態(tài)抑制由于神經(jīng)損傷導(dǎo)致的脊髓NMDAR活化，從而有效緩解神經(jīng)損傷導(dǎo)致的疼痛過敏[5]。脊髓過表達(dá)KCC2后是否對(duì)嗎啡耐受產(chǎn)生影響的研究，可以有效聯(lián)系疼痛過敏與嗎啡耐受，具有現(xiàn)實(shí)意義。興奮型氨基酸（Excitatory amino acid，EAA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，NMDAR是一種EAA受體，由不同亞單位組成四聚體或五聚體，NMDAR通常高表達(dá)在嗎啡耐受中，NMDAR參與了脊髓鞘內(nèi)嗎啡耐受中的作用，NMDAR參與嗎啡耐受的過程與胞內(nèi)胞漿Ca2+釋放及PKC激活有關(guān)，并對(duì)G蛋白的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，Ca2+激活PKC、PKA及CaMKII等。有研究表明抑制PKC或其他蛋白激酶的激活能夠延緩或減輕大鼠因重復(fù)給藥導(dǎo)致的嗎啡耐受和依賴[6-7]。阿米替林可以通過PSD-95/NMDAR /nNOS/PKC通路緩解嗎啡耐受，表現(xiàn)為突觸NMDAR的表達(dá)下調(diào)，抑制PKC的表達(dá)[8]。嗎啡耐受過程中NMDAR活化，故通過KCC2基因脊髓鞘內(nèi)注射，在脊髓過表達(dá)KCC2來抑制嗎啡耐受中NMDAR的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，KCC2過表達(dá)后進(jìn)行嗎啡耐受處理，NMDAR和PKC表達(dá)下調(diào)，初步說明NMDAR和PKC參與KCC2過表達(dá)后的嗎啡耐受調(diào)節(jié)，其更深的機(jī)制，還需進(jìn)一步探討。