劉皓涵，鐘迪穎，張潤光，王國良，張有林

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119）

0 引 言

歐李（Cerasus humilis(Bge.) Sok）又名“鈣果”，屬于薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬（Ceraras），是中國特有的果藥兼用型樹種[1]，生長于荒山或沙漠區(qū)，耐干旱，耐風寒，耐鹽堿，是一種適應性很強的野生果樹，歐李植株高約0.3～0.7 m，葉片長5.4 cm為綠色、葉片寬約3.2 cm，花期在 4月份左右，果實成熟期因地域和品種的原因大約在7月份左右。果實呈黃色或鮮紅色，直徑約2.5 cm，單果重約15 g，按硬度分為硬肉果實和軟肉果實2種[2-4]。歐李果營養(yǎng)豐富，鈣含量極高，有“綠色天然鈣源”的美譽，引起了人們的高度重視，近年來開始人工栽培，主要種植區(qū)為長江以北的省、市、自治區(qū)，資源相當豐富[5-8]。歐李果有機酸和酚類物質含量高，糖含量較低，多數(shù)品種口感酸澀[9-10]。多酚是重要的天然抗氧化物質，具有軟化血管、促進消化、降血脂、利尿、增加免疫力，防止動脈硬化和血栓的形成，具有抑制細菌與癌細胞生長的作用[11-14]，特別在抑制人體肝癌（HepG2）、結腸癌（HCT116）及胃癌（BGC823）細胞增殖方面的作用顯著[15]。目前關于歐李果中所含天然活性物質及其作用機理報道甚少，本試驗研究了歐李多酚類物質的提取和純化工藝，測定多酚類物質的種類和含量，探索多酚類物質的體外抗氧化活性，旨在為開發(fā)歐李果提供理論依據(jù)和技術支持[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

歐李（京歐2號）果實于2018年10月7日采于陜西省沙漠研究所，植株4 a生，果實9成熟，大小、 色澤一致，采摘當天運往果品冷庫儲藏備用。

試劑：果膠酶（20 000 U/g）由上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，沒食子酸標準品由天津一方科技有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)olin-Ciocalteus試劑、無水乙醇、石油醚、氯仿、氫氧化鈉、碳酸鈉、乙酸乙酯、HCl、抗壞血酸、過硫酸鉀、水楊酸鈉、焦性沒食子酸、硫酸亞鐵等其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

數(shù)顯鼓風干燥箱，GZX-9146MBE型，上海醫(yī)療設備廠生產(chǎn)；高效液相色譜儀，Thermo型，美國熱電公司生產(chǎn)；超聲波清洗儀，KQ320OB型，購于昆山市超聲儀器有限公司。高速萬能粉碎機，DFY-30型，溫嶺市林大機械有限公司生產(chǎn)；全波長酶標儀，9 Multiskan Go型，美國熱電公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機，TGL-16GR型，上海安亭有限公司生產(chǎn)；35mm×300 mm具四氟活塞層析柱，上海榮盛生物技術有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 歐李粉的制備

選取無蟲害、無腐爛的歐李果實，破果、去核、預凍后置于冷凍干燥機中凍干，用粉碎機以1 000 r/min粉碎，索氏提取法脫脂。脫脂方法：石油醚為溶劑，以料液比1∶40（g/mL）在50 ℃溫度下回流浸提 6 h。自然揮發(fā)石油醚后，將其置于鼓風干燥箱中在60 ℃溫度下干燥1 h，得歐李脫脂粉。

1.3.2 歐李多酚類物質提取方法

參考徐彩紅等[17]的方法，采用超聲輔助酶解法，稍作修改。在預試驗的基礎上，稱取3份歐李脫脂粉各1 g，分別放置在 3個相同的容量瓶中，果膠酶的添加量以果膠酶：歐李脫脂粉 1∶7（mg/g）分別加入，在容量瓶中分別加入60%乙醇溶液，使最終的液料比達到40∶1（mL/g），使用0.2 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值為6.0，在50 ℃水浴中酶解預處理 2 h，浸提結束后沸水浴滅酶，放置離心機中（6 000 r/min）離心10 min，取上清液，用60%乙醇定容至50 mL，用福林-酚比色法測定多酚含量。

1.3.3 提取液的選擇

參考高林曉等[18]的方法，稍作修改。準確稱取歐李脫脂粉1 g，分別用95%甲醇、95%乙醇、95%乙酸乙酯和 95%的乙醚以液料比 40∶1（mL/g）提取歐李多酚，將提取液放置離心機中（6 000 r/min）旋轉10 min，取上清液，定容至50 mL容量瓶備用。利用酶標儀在765 nm下測定上述提取液吸光度值，用沒食子酸繪制標準曲線方程y=0.010 4x+0.003 4，決定系數(shù)為R2=0.999 5，線性相關性良好。將測得的吸光度值代入上述標準曲線方程可算得最佳提取液。

1.3.4 總酚質量分數(shù)的測定

參考徐洪宇等[19]的方法，采用福林-酚比色法，稍作修改。利用1.3.3節(jié)沒食子酸標準曲線方程計算歐李果中多酚的提取量m。

式中A為樣品液吸光度值；0.003 4為空白吸光度值；v為樣品液體積，mL；d為樣品液稀釋倍數(shù)；0.010 4為沒食子酸標準曲線斜率。

式中M為樣品質量，g。

1.3.5 單因素試驗

分別選取酶解時間 40、70、90、120、150 min，液料比以（體積質量比）20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g，超聲波功率60、75、90、105、120 W，酶解溫度30、40、50、60、70 ℃，依次比較不同因素下各水平對歐李總多酚得率的影響，以期獲得超聲輔助酶解提取歐李總多酚的最優(yōu)水平。

1.3.6 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取對歐李多酚提取有顯著影響的酶解時間、酶解溫度、超聲波功率和液料比 4個因素為自變量，以歐李多酚提取量為響應值，進行中心組合試驗設計，試驗因素、水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 歐李多酚純化試驗

參考何婷等[20]的方法，采用大孔樹脂純化法，稍作修改。將歐李多酚粗提液旋轉蒸發(fā)回收乙醇得濃縮液，將LSA-5B型大孔樹脂用 95%乙醇活化好裝柱，采用濕法上樣。配制上樣液濃度為2.0 mg/mL，設定流速3 BV/h，上樣量為4 BV。吸附完成后用蒸餾水清洗樹脂，以60%的乙醇按3 BV/h的流速解吸附，收集第 3 BV洗脫液，旋轉蒸發(fā)回收，通過真空冷凍干燥即可得到歐李多酚純化物[21]。

1.3.8 歐李多酚成分測定

采用高效液相色譜法，參考馮媛媛[22]的方法，稍作修改。標準品的制備：精確稱取綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡因、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸的標準品各0.1 mg放置各自容量瓶中，用色譜級甲醇溶解分別定容至10 mL，得到1.0 mg/mL單標溶液，同時制備外標溶液。色譜條件：色譜柱為 Diamonsil 5μm C18(2)，4.6×250 nm，紫外檢測波長280 nm，柱溫30°C，進樣量10μL，流速l mL/min，用外標法測定含量。流動相A：甲醇∶乙腈∶甲酸為500∶499∶1；流動相B：水∶甲醇∶甲酸為949∶50∶1。

1.4 抗氧化活性指標

1.4.1 總還原力測定

參考Li等[23]，采用鐵氰化鉀還原法，稍作修改。取3 mL樣品液、3 mL鐵氰化鉀（1%）、3 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液混勻后，置于 55 ℃的水浴鍋中水浴30 min，冷卻后迅速加入3 mL三氯乙酸（10%），用離心機以5 000 r/min離心15 min，取上清液5、4 mL蒸餾水和2 mL FeCl3（0.2%）混勻，在波長700 nm處測定吸光度值。以蒸餾水為空白樣，測定3次取平均值。

1.4.2 DPPH·自由基清除力測定

參考Song 等[24]的方法，稍作修改。在10 mL容量瓶中依次加入制備好的DPPH·溶液4.0 mL和歐李多酚提取液4.0 mL，再加入無水乙醇定容至刻度，搖勻后立即用酶標儀在波長510 nm處測定吸光度值A0，同時將樣液在室溫下避光處理30 min，測定吸光度值A1，對照組加入DPPH·的乙醇溶液，其吸光值為A2，每個試樣平行測定3次，取其均值。DPPH·清除率用k(%)表示。

式中A0為乙醇吸光值；A1為含樣品吸光值；A2為對照組吸光值。

1.4.3 ABTS·自由基清除力測定

參考藤左[25]的方法，稍作修改。在10 mL容量瓶中依次加入7mmol/L的ABTS·溶液0.3 mL和3 mmol/L的K2S2O8溶液 0.3 mL混合均勻，在室溫條件下避光反應12 h，用95%乙醇稀釋50倍備用。分別取上述溶液0.8 mL 2份，分別加入0.2 mL 95%乙醇和0.2 mL歐李多酚提取液，充分搖勻10 s，靜置6 min，在波長734 nm處測定吸光度值A0和A'1，每個試樣測定 3次，取其均值。ABTS·清除率用k(%)表示。

式中A0為乙醇吸光值；A’1為歐李樣品吸光值。

1.4.4 羥基自由基清除力測定

參考李松林等[26]的方法，稍作修改。將5.0 mL歐李樣品液、3.0 mL FeSO4（0.3 mmol/mL）、2.0 mL水楊酸-乙醇（0.3 mmol/mL）和0.1 mLH2O2（0.03%）混合反應?？瞻撞惶砑親2O2溶液，在波長510 nm處測定吸光值，重復3次取均值A1。計算公式如下：

式中A3為蒸餾水吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

做3次平行測定，結果以平均值±標準差（±SD）表示。試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2010作圖、Origin2018 分析軟件統(tǒng)計分析。顯著水平P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 歐李多酚提取單因素試驗

2.1.1 酶解時間對歐李多酚提取量的影響

以樣品中歐李多酚含量作為判定指標，在預試驗的基礎上，固定酶解溫度50℃、超聲波功率105 W、液料比30∶1（mL/g），確定酶解時間對歐李多酚提取量的影響，結果見圖1。由圖1 看出，初期隨著酶解時間的增加，歐李多酚的提取量顯著提高，這是果膠酶破壞了歐李果肉果皮的細胞壁與細胞間質，使細胞內的物質快速溶出[27]。酶解時間達到 70 min時，提取量最高達（39±0.01）mg/g，且與酶解 40 min組差異顯著（P＜0.05）。這可能是當酶解時間達到70 min時，歐李果中的多酚幾乎全部溶出，如果再增加酶解時間，對歐李果多酚提取量影響不大，最適酶解時間以70 min為宜。

圖1 酶解時間對歐李多酚提取量的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of polyphenols from fructus auriculata

2.1.2 超聲波功率對歐李多酚提取量的影響

以樣品中歐李多酚提取量作為判定指標，在預試驗的基礎上，固定酶解溫度50 ℃、酶解時間70 min、液料比30∶1（mL/g），確定超聲波功率對歐李果多酚提取量的影響，結果見圖2。由圖2看出，初期隨著超聲波功率的增大，歐李多酚的提取量逐漸提高，這是大功率超聲波對歐李果細胞破壞程度大，有利于歐李多酚類物質的浸出[28]。超聲波功率達到 105 W 時，提取量最高達(40.83±0.02) mg/g，且與其他各組差異顯著（P＜0.05）。當超聲波功率超過105 W時歐李多酚提取量呈下降趨勢，這可能是超聲波功率過高會破壞歐李多酚類物質中的鄰二酚羥基等物質的結構，從而導致提取量下降[29]。因此提取歐李多酚的最佳超聲波功率為105 W。

圖2 超聲波功率對歐李多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from fructus auriculatus

2.1.3 酶解溫度對歐李多酚提取量的影響

以樣品中歐李多酚含量作為判定指標，在預試驗的基礎上，固定酶解時間70 min、超聲波功率105 W、液料比30∶1（mL/g），確定酶解溫度對歐李多酚提取量的影響，結果見圖3。由圖3看出，初期隨著酶解溫度的增加，歐李多酚的提取量顯著提高，這是適宜的溫度加速了酶促反應。當酶解溫度達到 50 ℃時，提取量最高達(40.03±0.12) mg/g，且與其他各組差異顯著（P＜0.05）。當酶解溫度高于50 ℃，歐李多酚提取量呈下降趨勢，這是因為高溫會導致果膠酶失活。因此本試驗提取歐李多酚酶解溫度以50 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對歐李多酚提取量的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of polyphenols from fructus auriculata

2.1.4 料液比對歐李多酚提取量的影響

以樣品中歐李多酚含量作為判定指標，在預試驗的基礎上，固定酶解溫度50 ℃、酶解時間70 min、超聲波功率105 W，確定液料比對歐李果多酚提取量的影響，結果見圖4。由圖4看出，初期隨著液料比的增加，多酚的提取量顯著提高，這是因為溶劑分子能溶解更多的溶質分子，從而有利于多酚類物質的浸出[30]。當液料比30∶1（mL /g）時，提取量最高達（39.962 ±0.05）mg/g，且與其他各組差異顯著（P＜0.05）。當液料比超過30∶1（mL /g）時，多酚提取量增加不顯著。提取歐李多酚最適液料比以30∶1（mL /g）為宜。

圖4 液料比對歐李多酚提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-material ratio on the extraction amount of cerasus humilis polyphenol

2.2 歐李多酚提取響應面試驗與結果分析

2.2.1 響應面試驗設計及回歸分析

在單因素試驗的基礎上，選用酶解溫度、酶解時間、超聲波功率、液料比4個因素為響應變量，依據(jù)Box-behnken Design原理，設計4因素3水平響應面試驗，結果見表2。

由表1試驗結果看出，利用軟件 Design Expert8.0.6得出各因素與歐李多酚提取量之間的回歸方程為

由方程看出，二次項的系數(shù)都是負數(shù)，表明拋物面開口向下，具有極大值點。

將以上回歸模型進行方差分析，結果見表3。模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），說明外界因素對試驗結果干擾較小[31]。模型的決定系數(shù)為R2=0.951 8，表明方程與實際測試數(shù)據(jù)吻合良好，能較好反映歐李多酚提取量與液料比、酶解時間、酶解溫度、超聲波功率的關系，該模型可用于分析和預測歐李多酚的提取條件。通過F檢驗確定回歸方程中每個變量對響應值影響的顯著性見表3。

2.2.2 響應面試驗

根據(jù)回歸方程制作的響應面立體分析圖和等高線圖見圖5、圖6。圖5、圖6分別反映了4個因素（液料比、酶解時間、酶解溫度、超聲波功率）兩兩交互作用對響應值的影響，等高線形狀近似圓形表示二者交互作用不明顯，近似橢圓形則表示二者的交互作用明顯。

表2 響應面試驗設計與試驗結果Table 2 Design and test results of response surface

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

由圖5響應面圖看出，酶解時間和酶解溫度取0水平時，隨著料液比和超聲波功率的變化歐李多酚提取量呈先增大后減小的趨勢。由等高線圖看出料液比比超聲波功率區(qū)域排列更為緊密，說明料液比對多酚提取量影響更大，等高線圖近似橢圓形表示料液比和超聲功率之間存在一定的交互作用，對歐李多酚的影響顯著[32]。

圖5 料液比與超聲波功率對歐李多酚提取量的交互影響Fig.5 Interaction effects of liquid-material ratio and ultrasonic power on the extraction amount of polyphenols from cerasus humilis

由圖6響應面圖看出，在料液比和超聲功率取零水平時，隨著酶解時間和酶解溫度的變化歐李多酚提取量呈先增大后減小的趨勢。由等高線看出酶解溫度比酶解時間區(qū)域排列更為緊密，說明酶解溫度對多酚提取量影響更大，等高線圖近似橢圓形表示酶解時間和酶解溫度之間存在一定的交互作用[33]。

圖6 酶解溫度與酶解時間對歐李多酚提取量的交互影響Fig.6 interaction effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of polyphenols from cerasus humilis

2.2.3 回歸模型的驗證

為進一步驗證預測值，將預測模型的最佳提取條件進一步驗證：超聲功率為105 W、酶解溫度為50 ℃、酶解時間為 80 min、液料比 30∶1（mL/g），在此條件下重復3次試驗，歐李多酚平均提取量為42.63 mg/g，比優(yōu)化前增加約2 mg/g，與預測值擬合率為99.49%，表明預測值和實際值吻合良好，優(yōu)化模型可靠。用LSA-5B大孔樹脂經(jīng)動態(tài)吸附和解吸附后獲得歐李多酚純化物，總酚含量為73.42 mg/g，表明本試驗所確定的優(yōu)化方案設計合理，獲得的提取條件可以顯著提高歐李多酚提取量。

2.3 歐李多酚類物質測定

用高效液相色譜儀對提取純化物的歐李多酚進行測定。歐李多酚類物質主要有沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、咖啡因，其含量見表4。

表4 歐李多酚類物質種類及質量濃度(n=3)Table 4 Types and concentrations of polyphends in cerasus humilis (n=3)

2.4 歐李多酚類物質體外抗氧化活性

2.4.1 歐李多酚的總還原能力

由圖7看出，在質量濃度相同的情況下，歐李果實多酚類物質純化物、粗提物和Vc三者還原能力強弱如下：維生素 C(IC50=35.05μg/mL)＞歐李多酚純化物(IC50=32.42μg/ mL) ＞歐李多酚粗提(IC50=30.13μg/ mL)。歐李多酚純化物的還原能力與維生素C差異不顯著（P＞0.05），與粗提物差異顯著（P＜0.05）。由此可見，純化過程除去雜質且但不影響主要成分的活性，可提高總還原能力。

圖7 歐李多酚總還原能力Fig.7 Total reducing capacity of cerasus humilis polyphenol

2.4.2 歐李多酚清除ABTS·自由基的能力

由圖8看出，歐李多酚純化物、歐李多酚粗提物、維生素C對ABTS·均具有清除能力，且歐李多酚純化物和歐李多酚粗提物對ABTS·的清除能力相當，但均大于Vc。在質量濃度相同的情況下，歐李果實多酚類物質純化物、粗提物和 Vc三者清除 ABTS·自由基的能力為：歐李多酚純化物(IC50=55.45μg/mL)＞歐李多酚粗提物 (IC50=51.12μg/mL) ＞維生素C (IC50=49.87μg/mL)，各組間差異顯著（P＜0.05）。

2.4.3 歐李多酚清除DPPH·自由基的能力

由圖9看出，在質量濃度相同的情況下，歐李多酚純化物、歐李多酚粗提物、維生素C對DPPH·均具有清除能力，其中歐李多酚純化物對DPPH·的清除能力小于Vc但強于歐李多酚粗提物，歐李果實多酚類物質純化物、粗提物和 Vc三者清除 DPPH·自由基的能力具體為：維生素 C(IC50=115.79μg/mL)＞歐李多酚純化物(IC50= 110.12μg/ mL)＞歐李多酚粗提物(IC50=98.42μg/ mL)，各組間差異顯著（P＜0.05）。

圖8 歐李多酚清除ABTS·自由基的作用Fig.8 Scavenging effects of cerasus humilis polyphenol on ABTS·free radicals

2.4.4 歐李多酚清除·OH自由基的能力

由圖10看出，當總酚濃度小于100μg/mL時，歐李多酚純化物清除·OH自由基的能力顯著高于歐李多酚粗提物和Vc，但濃度大于100μg/mL時，三者清除·OH自由基的能力相當。但在質量濃度相同的情況下，歐李果實多酚類物質純化物、粗提物和Vc三者清除·OH自的能力為：歐李多酚純化物 (IC50=72.65μg/mL)＞歐李多酚粗提物(IC50=66.92μg/mL) ＞維生素 C (IC50=60.42μg/mL)，純化物與粗提物之間差異不顯著（P＞0.05），但純化物和粗提物與Vc之間差異顯著（P＜0.05）。

圖10 歐李多酚清除·OH自由基的作用Fig.10 . Scavenging effects of cerasus humilis polyphenol on·OH free radicals

3 討 論

1）歐李是中國特有的一種野生果樹，其果實營養(yǎng)和功能性成分豐富，由于受歐李品種及地域的差異，歐李多酚含量也會有差異。本試驗采用單因素及響應面優(yōu)化試驗研究了歐李多酚超聲輔助酶解提取工藝。采用了傳統(tǒng)提取工藝輔助酶解，這種提取工藝既加快了化學反應速率，又提高了多酚的提取量，但耗能較高。

2）采用大孔樹脂純化歐李多酚粗提物，歐李多酚純度會受試驗器材、人為操作、大孔樹脂種類等因素影響。同時利用高效液相色譜法測定酚類物質的種類，也會因為標準品種類受限，有些酚類物質可能未完全比對出來，最后利用分光光度法測定歐李多酚類物質總還原力和對自由基·OH、DPPH·、ABTS·的清除作用，根據(jù)歐李多酚的總還原力及抗氧化性結果，純化過程除去雜質且但不影響主要成分的活性，可提高總還原能力及抗氧化能力。綜合來講，本試驗具有較大的實踐意義和參考價值。

4 結 論

歐李多酚以超聲輔助果膠酶提取為好，經(jīng)單因素試驗及響應面優(yōu)化試驗得到提取最佳工藝參數(shù)為：超聲波功率105 W、酶解溫度50 ℃、酶解時間80 min、液料比30∶1（mL/g）在該條件下多酚提取率為 42.63 mg/g。使用LSA-5B大孔樹脂純化歐李多酚，純化物中歐李多酚含量73.42 mg/g，純化效果明顯。

從歐李多酚中檢測出6種酚類物質，其含量順序依次為綠原酸＞沒食子兒茶素沒食子酸酯＞對羥基苯甲酸＞咖啡因＞沒食子酸＞原兒茶酸。歐李多酚對 DPPH·、ABTS·、·OH自由基均有良好的清除能力，歐李多酚純化物清除·OH的 IC50值為 72.65μg/mL，清除 DPPH·的 IC50值為110.12μg/mL，清除 ABTS·的 IC50值為 55.45μg/mL，總還原力EC50值為32.42μg/mL，與Vc作用相當。歐李果多酚粗提物清除·OH 的 IC50值為 66.92μg/mL，清除DPPH·的 IC50值為 98.42μg/mL，清除 ABTS·的 IC50值為49.87μg/mL，總還原力值為 30.13μg/mL。