郭展宏 臧璞 郭青玉 楊翠華 邵加慶

(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210002)

近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活節(jié)奏的改變，以肥胖為代表的代謝性疾病的發(fā)病率顯著上升。過量攝入脂肪會導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗，抑制骨骼肌蛋白質(zhì)合成的上游信號傳導(dǎo)，引起肌肉質(zhì)量減少〔1〕。衰老和骨骼肌脂肪堆積也被認(rèn)為對骨骼肌質(zhì)量具有顯著的負(fù)面影響〔2〕。動物研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的小鼠骨骼肌損傷后，后肢肌肉減少，肌纖維數(shù)量也隨之減少〔3〕。此外，HFD亦可引起骨骼肌線粒體功能受損，導(dǎo)致運(yùn)動能力下降和肌肉易疲勞〔4〕。肥胖所致抗疲勞能力的下降對機(jī)體健康和生活質(zhì)量均產(chǎn)生明顯負(fù)面影響。

胃饑餓素(Ghrelin)是胃底黏膜分泌的一種腦腸肽，在體內(nèi)主要以去?；葛囸I素(DAG)形式存在。Ghrelin可作用于體內(nèi)諸多臟器并發(fā)揮廣泛生理作用。近年研究發(fā)現(xiàn)ghrelin?；问?AG)可通過激活乙酰輔酶A羧化酶促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化〔5〕，抑制肌肉萎縮，改善老年性肌無力，且能夠影響 運(yùn)動耐力〔6，7〕。而DAG并不激活經(jīng)典Ghrelin受體生長激素促泌劑受體(GHS-R)1a，對肌肉耐力的影響及機(jī)制尚不明確。本研究通過建立HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型，旨在探究DAG對肥胖小鼠抗疲勞能力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組 C57BL/6小鼠36只(SPF，雄性，6周齡，購自南京大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)，飼養(yǎng)于屏障動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)(環(huán)境溫度保持在22～24℃，相對濕度保持在50%～70%，12 h交替照明，自由進(jìn)食水)，正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。36只小鼠隨機(jī)平均分為3組：對照(NC)組、高脂(HFD)組、HFD+DAG組，每組12只。分別予以含10%脂肪和70%碳水化合物的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)(NC組)、含60%脂肪和20%碳水化合物的高脂飼料喂養(yǎng)(HFD組、HFD+DAG組)。三組小鼠分別給予每日腹腔注射生理鹽水10 ml/kg(NC組，HFD組)、DAG0.8 mg/kg(HFD+DAG組)。DAG購自加拿大AnaSpec公司，標(biāo)準(zhǔn)飼料(D12450J)及高脂飼料(D12492)均購自美國Research Diets公司。

1.2小鼠跑步運(yùn)動耐力實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)15 w時(shí)使用電動跑臺(ZH-PT型，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)行力竭測試：所有小鼠連續(xù)3 d適應(yīng)跑臺，持續(xù)時(shí)間為10 min，速度為10 m/min，跑臺傾斜10°。第4天時(shí)所有小鼠以初始速度10 m/min(10°坡度)在跑臺上跑步，以0.5 m/min的速度加速至最高25 m/min。直到因小鼠力竭而終止實(shí)驗(yàn)，記錄下跑步距離代表小鼠運(yùn)動能力。小鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)：在運(yùn)動過程中，電刺激頻率在4次/min以上，不能維持原強(qiáng)度運(yùn)動，10 min短暫休息后，不能恢復(fù)運(yùn)動能力且刺激驅(qū)趕無效，即判斷為力竭。

1.3小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 所有小鼠在喂養(yǎng)16 w后行負(fù)重游泳試驗(yàn)：稱量小鼠，在鼠尾根部負(fù)荷10%體重的鉛皮。隨后放置于水深30 cm，水溫25℃的水槽中，待小鼠沉入水底后將其及時(shí)撈出。記錄小鼠自游泳開始至沉入水底的時(shí)間，作為小鼠游泳力竭時(shí)間。完成負(fù)重游泳試驗(yàn)后即處死小鼠，取出單側(cè)腓腸肌及股四頭肌并稱重，計(jì)算腓腸肌或股四頭肌指數(shù)=腓腸肌質(zhì)量或股四頭肌質(zhì)量(g)/體重(g)。取血分離血清，檢測小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肝糖原、肌糖原水平。LDH活性檢測試劑盒(BC0680)、LA含量檢測試劑盒(BC2235)、BUN含量檢測試劑盒(BC1535)、糖原含量檢測試劑盒(BC0345)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體重與主要肌肉指數(shù)變化 實(shí)驗(yàn)于給藥16 w后結(jié)束，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重均呈增長趨勢見表1。自給藥第2周開始，HFD組小鼠體重明顯高于NC組(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+DAG組小鼠體重未見明顯差異(P>0.05)。給藥16 w后，HFD組腓腸肌及股四頭肌指數(shù)較NC組顯著下降(P<0.05)；與HFD組相比，HFD+DAG組小鼠腓腸肌及股四頭肌指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組不同時(shí)間小鼠體重比較

表2 各組腓腸肌及股四頭肌指數(shù)比較

2.2各組跑臺力竭運(yùn)動距離與游泳力竭時(shí)間比較 與NC組相比，HFD組運(yùn)動距離及游泳力竭時(shí)間明顯縮短(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組運(yùn)動距離及游泳力竭時(shí)間顯著延長(P<0.05)。見表3。

2.3各組BUN、LDH及LA水平比較 與NC組相比，HFD組血清BUN、LA顯著升高，LDH顯著下降(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組BUN、LA均明顯下降，LDH明顯升高(P<0.05)。見表4。

表3 各組跑臺力竭運(yùn)動距離及游泳力竭時(shí)間比較

表4 各組血清生化指標(biāo)比較

2.4各組肝糖原和肌糖原水平比較 與NC組相比，HFD組肝糖原和肌糖原含量均明顯下降(P<0.01)；與HFD組相比，HFD+DAG組肝糖原和肌糖原含量均明顯升高(P<0.01)。見表5。

表5 各組肝糖原和肌糖原水平比較

3 討 論

研究表明肥胖可導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞線粒體功能受損、運(yùn)動耐力下降〔8〕。運(yùn)動耐力是對機(jī)體疲勞程度最客觀直接的反映，在動物實(shí)驗(yàn)中電動跑臺力竭測試和負(fù)重游泳試驗(yàn)是反映實(shí)驗(yàn)動物運(yùn)動耐力和測試藥物抗疲勞效果的有效手段〔9，10〕。本研究利用上述方法評估小鼠運(yùn)動耐力發(fā)現(xiàn)相比NC組，HFD組小鼠體重顯著上升，運(yùn)動耐力明顯降低，與既往研究一致〔11〕。

近年研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可促進(jìn)骨骼肌再生和衛(wèi)星細(xì)胞自我更新，同時(shí)抑制骨骼肌活性氧自由基產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)〔12〕。Mani等〔6〕發(fā)現(xiàn)運(yùn)動引起的血漿總Ghrelin水平的增加與耐力呈正相關(guān)；與野生型同窩小鼠相比，Ghrelin受體基因敲除小鼠的力竭時(shí)間明顯縮短。本研究顯示長期應(yīng)用DAG可明顯增加肥胖小鼠的跑臺力竭運(yùn)動距離并延長游泳力竭時(shí)間，表明DAG對肥胖小鼠具有顯著的抗疲勞作用。上述作用可能與DAG干預(yù)肌肉代謝有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)DAG可通過激活肌管中的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Kβ)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體(mTORC)2及p38信號通路，抑制地塞米松誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮〔13〕。此外，在Ghrelin受體基因敲除(Ghsr-/-)的小鼠中，DAG可誘導(dǎo)骨骼肌中絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化，改善禁食引起的肌萎縮〔13〕。由于DAG不能激活GHSR-1a，因而其抗疲勞作用發(fā)揮可能并不依賴于GHSR-1a受體途徑，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

在劇烈運(yùn)動過程中，肌肉組織的主要供能方式由有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧酵解，肌糖原被快速消耗并產(chǎn)生大量LA，并影響Ca2+的釋放，從而抑制肌肉收縮能力并導(dǎo)致疲勞〔14〕。LDH可將LA中的氫解離重新還原成丙酮酸，從而緩解LA堆積。因此，小鼠運(yùn)動能力與乳酸含量呈反比，而與LDH呈正比。本研究結(jié)果表明DAG干預(yù)可防止LA堆積并加速LA清除，同時(shí)升高LDH水平，發(fā)揮抗疲勞作用。BUN是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的主要產(chǎn)物。隨著運(yùn)動強(qiáng)度和時(shí)間的增加，碳水化合物和脂肪所產(chǎn)生的能量不足以滿足機(jī)體需求，隨后蛋白質(zhì)和氨基酸被分解供能導(dǎo)致BUN升高。BUN水平一定程度反映了機(jī)體疲勞狀態(tài)。本研究表明DAG干預(yù)組小鼠血清BUN水平明顯降低，疲勞狀態(tài)得到緩解。

血糖、肝糖原和肌糖原是體內(nèi)三大糖儲備。長時(shí)間劇烈運(yùn)動消耗血糖，糖原將成為重要供能物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，肌糖原含量的增加可明顯改善小鼠運(yùn)動能力〔15〕。糖原含量亦可作為反映機(jī)體運(yùn)動耐力的重要指標(biāo)〔16〕。本研究結(jié)果表明DAG干預(yù)亦可通過增加機(jī)體糖原儲備，提高運(yùn)動耐力。

綜上所述，應(yīng)用DAG有助于提高肥胖小鼠的運(yùn)動耐力和抗疲勞能力。同時(shí)，有研究顯示DAG亦能夠降低肥胖機(jī)體本身胰島素抵抗及炎癥狀態(tài)〔12〕。本研究結(jié)果為提高肥胖患者運(yùn)動效果與生活質(zhì)量等提供了新的思路，然而DAG抗疲勞相關(guān)作用機(jī)制目前尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。