羅生慧，隨 慧，包 靜，麥麥提艾力·阿卜杜納斯?fàn)枺?白雪瑩，呂國(guó)會(huì)，劉小寧

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

棉鈴蟲(chóng)是主要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，是棉花蕾鈴期的主要害蟲(chóng)，對(duì)其它農(nóng)作物也具有巨大的危害性。因其具有廣泛寄主范圍以及轉(zhuǎn)移危害的習(xí)性，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑因?yàn)槭褂梅奖?、作用快速而被作為主要控制害蟲(chóng)的方法，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物導(dǎo)致抗藥性增加(Aktaretal., 2009)。因此，需要尋找一種環(huán)境友好型的害蟲(chóng)防治方法。研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)是構(gòu)成昆蟲(chóng)角質(zhì)層、表皮、腸道及圍食膜的主要成分，而高等動(dòng)植物體內(nèi)不存在幾丁質(zhì)，因此，可以通過(guò)幾丁質(zhì)降解酶來(lái)破壞棉鈴蟲(chóng)中幾丁質(zhì)的代謝平衡，從而可以達(dá)到綠色防治棉鈴蟲(chóng)的目的。

幾丁質(zhì)(Chitin)是昆蟲(chóng)外骨骼角質(zhì)層、圍食膜、頭殼、體壁等部位的主要成分，用以保護(hù)昆蟲(chóng)并維持昆蟲(chóng)的體型，還可以限制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)。幾丁質(zhì)是在昆蟲(chóng)內(nèi)表皮和外表皮或在新分泌的、非硬化的前表皮中發(fā)現(xiàn)的，且在昆蟲(chóng)的整個(gè)生命過(guò)程中幾丁質(zhì)的降解與合成是一直存在的(Lehane, 1997; 張嚴(yán)峻等，2000；相靜波，2004；張八生，2007；Hegedusetal., 2009)。在昆蟲(chóng)的整個(gè)生命周期中，昆蟲(chóng)必須降解舊的角質(zhì)層同時(shí)合成新角質(zhì)(Hataetal., 1996; Merzendorfer and Zimoch, 2003; Muthukrishnanetal., 2012)，即蛻皮現(xiàn)象(Nijhoutetal., 1981)。而昆蟲(chóng)的蛻皮過(guò)程是由幾丁質(zhì)酶(chitinase)和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(β-N-acetyglucosaminidase)協(xié)同完成的(Fukamizoetal., 1985)。

幾丁質(zhì)酶(chitinase, CHT)是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段起著至關(guān)重要的作用，在蛻皮、圍食膜的降解以及消化等重要生理過(guò)程(Shietal., 2004; Zhuetal., 2008; Arakaneetal., 2010; Jasrapuriaetal., 2010; Quetal., 2014)均與幾丁質(zhì)酶息息相關(guān)。幾丁質(zhì)酶是一類具生物催化活性的水解酶，能特異性水解成形的幾丁質(zhì)。隨著生物技術(shù)及生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶及其類似蛋白的催化域進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，可將昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶劃分為十個(gè)(Ⅰ-Ⅹ)類型(group)(Arakaneetal., 2003; Zhangetal., 2011; 夏夢(mèng)，2015；Liuetal., 2018)，每個(gè)類型幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中執(zhí)行不同的生理功能，其中II型幾丁質(zhì)酶包括4～5個(gè)催化域和4～7個(gè)CBD區(qū)主要與蛻皮發(fā)育相關(guān)(李大琪等，2011)；III型幾丁質(zhì)酶包含2個(gè)催化域和一個(gè)CBD區(qū)，在N端含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于膜結(jié)合蛋白，參與昆蟲(chóng)蛹化后腹部的收縮和翅的伸展(范曉軍等，2013)；IV型幾丁質(zhì)酶主要由一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)催化域組成，大部分缺失CBD區(qū)，參與圍食膜的降解與更新，抵抗含有幾丁質(zhì)的有害病原菌，對(duì)昆蟲(chóng)起免疫保護(hù)作用(Khajuriaetal., 2010)；V型幾丁質(zhì)酶包含一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)催化域，但缺乏CBD區(qū)，可作為生長(zhǎng)因子，來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的增值能力(Zhuetal., 2008)；VI型幾丁質(zhì)酶分子量較大，在C端有一個(gè)較長(zhǎng)的富含Ser/Thr的高度糖基化無(wú)規(guī)則卷曲，可用來(lái)保護(hù)相似結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶不被降解(Yasuyuki and Subbaratnam, 2010)。本文主要對(duì)I型幾丁質(zhì)酶和VII型幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)和不同時(shí)空表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。Ⅰ型幾丁質(zhì)酶(通常CHT5屬于I型幾丁質(zhì)酶)主要參與昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中舊表皮的消化，目前已經(jīng)在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目昆蟲(chóng)中進(jìn)行研究。Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因在昆蟲(chóng)表皮中的表達(dá)量最大(仙笑笑等，2012)，該類酶的結(jié)構(gòu)域含有N-末端信號(hào)肽、催化域(catalic domain, CAD)、連接區(qū)(linker)以及C-末端的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitinase binding domain, CBD)(張常，2014)，CBD會(huì)增強(qiáng)酶對(duì)幾丁質(zhì)的親和能力(夏夢(mèng)，2015)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)I型幾丁質(zhì)酶被RNAi沉默時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛻皮失敗，甚至使昆蟲(chóng)死亡，這表明I型幾丁質(zhì)酶在蛻皮過(guò)程中參與新舊角質(zhì)層的更新(Nohetal., 2018)。對(duì)于昆蟲(chóng)赤擬谷盜Triboliumcastaneum而言，Ⅰ型幾丁質(zhì)酶不正常的表達(dá)將導(dǎo)致其不能成功的從幼蟲(chóng)變?yōu)橛?，表明Ⅰ型幾丁質(zhì)酶對(duì)外骨骼或圍食膜幾丁質(zhì)的降解有重要作用(Zhangetal., 2012；張常，2014；Nohetal., 2018)。Ⅶ型幾丁質(zhì)酶包含一個(gè)信號(hào)肽和單一的CAD，沒(méi)有CBD，該類幾丁質(zhì)酶的功能尚不明確，有待進(jìn)一步研究(Liuetal., 2018)。

昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶作為分解昆蟲(chóng)體壁、中腸、圍食膜等組織中幾丁質(zhì)的重要水解酶，在昆蟲(chóng)的消化、變態(tài)等生理活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，幾丁質(zhì)酶的過(guò)量或缺失都可影響到昆蟲(chóng)的正常發(fā)育。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)HaCHT I可以降解膠體幾丁質(zhì)，而HaCHT VII對(duì)膠體幾丁質(zhì)則沒(méi)有降解活性，但其可將寡聚糖降解成單糖，本研究以此為基礎(chǔ)對(duì)棉鈴蟲(chóng)I型和Ⅶ型幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域及其基因表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了比較分析。為其功能的進(jìn)一步探究奠定基礎(chǔ)，也為棉鈴蟲(chóng)生物防治提供有利信息。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)

棉鈴蟲(chóng)是由新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度26±2℃，RH65%±5%，光周期16 h ∶8 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

RNA提取試劑盒(Trans Zol Up Plus RNA Kit)購(gòu)于北京全式金公司；Real master mix SYBR green PCR試劑盒購(gòu)買(mǎi)于invitrogen公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭灰锖铣杉皽y(cè)序均由上海生工完成。

1.3 結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)利用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)對(duì)本課題組前期克隆獲得的棉鈴蟲(chóng)的I型和VII型幾丁質(zhì)酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的蛋白結(jié)構(gòu)域，并標(biāo)注信號(hào)肽、催化結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)酶保守區(qū)以及幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

1.4 棉鈴蟲(chóng)總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

為研究HaCHTI和HaCHTVII在棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的蛻皮階段的表達(dá)規(guī)律，本研究收集了棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段蛻皮前后的中腸組織，同時(shí)收集了棉鈴蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)的頭殼、前腸、中腸、后腸、脂肪體、體壁，收集的所有組織均在-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照制造商的說(shuō)明提取總RNA，將1 μg的總RNA合成為cDNA：首先，將Oligo d(T)18引物加入到總RNA中，并在70℃下溫育10 min，后在冰上快速冷卻5 min。然后加入MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，在42℃孵育1 h，72℃孵育15 min。最后將反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物在冰上冷卻并儲(chǔ)存在-80℃以進(jìn)行qRT-PCR。

1.5 棉鈴蟲(chóng)HaCHT I和HaCHT VII 在不同發(fā)育階段蛻皮前后和不同組織中的表達(dá)量

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件和 primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了引物，HaCHTI(GenBank accession number：AAQ91786.1)的正向引物：5′-ATGA GAGTGATACTAGCGACGTTGGC-3′；反向引物：5′-CTAAGGCGTCCTGTTCATGAGC CGG-3′。HaCHTVII(GenBank accession number：XP_021180780.1)正向引物：5′-ATGAAAGTTTTA AGTTTATTCTTTGTT-3′；反向引物：5′-CTACAA ATTCAACACAAAAGCTACAGAC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaCHTⅠ和HaCHTⅦ結(jié)構(gòu)域的比較

本研究通過(guò)利用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)HaCHTⅠ和HaCHT Ⅶ的信號(hào)肽序列、催化區(qū)域、連接區(qū)域和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖1)。分析表明，HaCHTⅠ包括4個(gè)區(qū)域：N-末端信號(hào)肽、一個(gè)催化域、連接區(qū)以及C-末端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而HaCHTⅦ僅含有一個(gè)N-末端信號(hào)肽、一個(gè)催化域和一個(gè)連接區(qū)。

圖1 HaCHTⅠ和HaCHTⅦ結(jié)構(gòu)域的比較Fig.1 Domain comparison between HaCHTⅠ and HaCHTⅦ

2.2 HaCHT I和HaCHT VII 在棉鈴蟲(chóng)不同組織的表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)HaCHTI在棉鈴蟲(chóng)不同組織的表達(dá)量，如圖2-A結(jié)果顯示HaCHTI在棉鈴蟲(chóng)的所有組織部位均有表達(dá)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。圖2-B結(jié)果顯示的是HaCHTVII在棉鈴蟲(chóng)不同組織的表達(dá)量，HaCHTVII在棉鈴蟲(chóng)所有組織部位也均有表達(dá)，其中在頭殼和體壁中的表達(dá)量顯著高于前腸、中腸、后腸和脂肪體(P<0.05)；脂肪體中表達(dá)量顯著高于前腸、中腸、后腸(P<0.05)；前腸、中腸、后腸中沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 HaCHT I和HaCHT VII 在棉鈴蟲(chóng)不同組織的表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of HaCHT I and HaCHT VII in different tissue of Helicoverpa armigera注：Head, 頭殼; FG, 前腸; MG, 中腸; HG, 后腸; FB, 脂肪體; BW, 體壁。 A，HaCHTI在不同組織中的表達(dá)量；B，HaCHT VII 在不同組織中的表達(dá)量，qRT-PCR進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，2個(gè)技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析。Note: Head; FG, Foregut; MG, Midgut; HG, Hindgut; FB, Fat Bady; BW, Bady Wall. A, Expression amount of HaCHT I in different tissue; B, Expression amount of HaCHT VII in different tissue. Three biological replications and two technical replications were performed by qRT-PCR, and the data were analyzed by one-way ANOVA.

2.3 HaCHT I和HaCHT VII在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)蛻皮前后中腸中的表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)HaCHTI和HaCHTVII基因在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)量，結(jié)果表明HaCHTI和HaCHTVII基因在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)3齡末至預(yù)蛹階段在中腸中均有表達(dá)。3齡末期HaCHTI表達(dá)量顯著高于4齡末期(P<0.05)，4齡末期HaCHTI表達(dá)量顯著高于5齡、6齡末期及蛹期(P<0.05)，5齡、6齡末期及蛹期沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，總體分析HaCHTI在3齡、4齡、5齡、6齡末期及蛹期時(shí)的表達(dá)量呈遞減的趨勢(shì)(圖3-A)；4齡、6齡初期HaCHTI基因的表達(dá)量均顯著高于5齡初期(P<0.05)，總體分析HaCHTI基因的表達(dá)量在4齡、5齡、6齡初期時(shí)呈先減后增的趨勢(shì)(圖3-B)。而同一時(shí)期HaCHTVII和HaCHTI基因的表達(dá)量幾乎成相反關(guān)系。在3齡、4齡末期時(shí)HaCHTⅦ的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異，但均顯著低于5齡末期(P<0.05)，5齡末期HaCHTVII表達(dá)量又顯著低于6齡末期與蛹期(P<0.05)，6齡末期與蛹期沒(méi)有顯著性差異，總體分析HaCHTVII在3齡、4齡、5齡、6齡末期及蛹期時(shí)的表達(dá)量呈遞增的趨勢(shì)(圖3-C)。4齡、5齡初期HaCHTVII的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，但顯著高于6齡初期(P<0.05)，總體分析HaCHTVII的表達(dá)量呈遞減的趨勢(shì)，與HaCHTI在不同齡期的初期表達(dá)量模式不同(圖3-D)。

圖3 HaCHT I和HaCHT VII 在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育階段的表達(dá)量Fig.3 Expression of HaCHT I and HaCHT VII in the developmental stage of Helicoverpa armigera larvae注：3rdM，3齡末期；4thM，4齡末期；5thM，5齡末期；6thM，6齡末期；Pupa，蛹期；4thC，4齡初期；5thC，5齡初期；6thC，6齡初期。A，HaCHT I在幼蟲(chóng)3齡、4齡、5齡、6齡末期以及蛹期的表達(dá)量；B，HaCHT I在幼蟲(chóng)4齡、5齡、6齡初期表達(dá)量；C，HaCHT VII 在幼蟲(chóng)3齡、4齡、5齡、6齡末期以及蛹期的表達(dá)量；D，HaCHT VII 在幼蟲(chóng)4齡、5齡、6齡初期的表達(dá)量。qRT-PCR進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，2個(gè)技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析。Note: 3rdM, 3 inster telephase; 4thM, 4 inster telephase; 5thM, 5 inster telephase; 6thM, 6 inster telephase; Pupa, Pupa stage; 3rdC, 3 inster initial; 4thC, 4 inster initial; 5thC, 5 inster initial; 6thC, 6 inster initial. A，Expression amount of HaCHT I at the end of the 3rd, 4th, 5th and 6th instar and the pupal stage of H. armigera; B，Expression amount of HaCHT I at the beginning of the 4th, 5th and 6th instar of H. armigera; C，Expression amount of HaCHT VII at the end of the 3rd, 4th, 5th and 6th instar and the pupal stage of H. armigera; D，Expression amount of HaCHT VII at the beginning of the 4th, 5th and 6th instar of H. armigera. Three biological replications and two technical replications were performed by qRT-PCR, and the data were analyzed by one-way ANOVA.

3 結(jié)論與討論

在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，由幾丁質(zhì)組成的外骨骼及中腸的圍食膜限制了體內(nèi)器官的生長(zhǎng)，因此，昆蟲(chóng)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)蛻皮現(xiàn)象(Riddifordetal., 2016)。在昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶負(fù)責(zé)消化圍食膜和外骨骼中的幾丁質(zhì)。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是數(shù)量龐大且結(jié)構(gòu)多樣化的酶家族(Merzendorfer and Zimoch, 2003)。近年來(lái)，由于其在幾丁質(zhì)代謝中的重要生化功能而倍受關(guān)注。幾丁質(zhì)酶是一種內(nèi)切酶，可降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶及其類似蛋白的催化域進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，可將昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶至少劃分為10種類型(Arakaneetal., 2003; Zhangetal., 2011; 夏夢(mèng)，2015；Liuetal., 2018)，每種類型具有各自的結(jié)構(gòu)，其中有些幾丁質(zhì)酶具有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域，即幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD區(qū))。CBD是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，具有6個(gè)保守的半胱氨酸，可能形成了3個(gè)二硫鍵(Sinuetal., 2010)。其中CBD結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)幾丁質(zhì)酶與不溶性底物之間的親和性，所以含有CBD結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶可能對(duì)降解多聚幾丁質(zhì)比降解幾丁寡糖更加有效(Yasuyukietal., 2003)。

本研究對(duì)棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶HaCHTⅠ和HaCHTⅦ以及前期所獲得的HaCHTⅣ的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HaCHTⅠ和HaCHTⅣ在結(jié)構(gòu)上都具有CBD區(qū)，而HaCHTⅦ則沒(méi)有CBD區(qū)。本課題組前期對(duì)HaCHTⅠ和HaCHTⅣ的底物探索發(fā)現(xiàn)，兩者均具有降解膠體幾丁質(zhì)的作用(古新蓉等，2019；麥麥提艾力等，2019)。在幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶的CBD就會(huì)錨定膠體幾丁質(zhì)，增加對(duì)底物的親和能力(Zhuetal., 2008)。當(dāng)幾丁質(zhì)酶沒(méi)有CBD結(jié)構(gòu)域時(shí)，也可降解幾丁質(zhì)，但是其活性很低(Gentaetal., 2009)。赤擬谷盜體內(nèi)，異常表達(dá)的Ⅰ型幾丁質(zhì)酶則會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)無(wú)法順利的從幼蟲(chóng)蛻變?yōu)橛?，說(shuō)明Ⅰ型幾丁質(zhì)酶在參與角質(zhì)層幾丁質(zhì)降解或圍食膜的更換中起重要作用。大多數(shù)Ⅳ型幾丁質(zhì)酶在中腸或脂肪體中表達(dá)，還有少數(shù)Ⅳ型幾丁質(zhì)酶具有特異的表達(dá)時(shí)期(Zhuetal., 2008)，Ⅳ型幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域組成以及表達(dá)方式的特殊，說(shuō)明其對(duì)昆蟲(chóng)具有十分重要的生理功能。有相關(guān)研究報(bào)道，當(dāng)沉默歐洲玉米螟Ostrinianubilalis體內(nèi)的Ⅳ型幾丁質(zhì)酶(OnCHT)時(shí)，其中腸圍食膜的孔徑變小而且對(duì)食物的消化速率有明顯的下降，最終會(huì)影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至?xí)种评ハx(chóng)的生長(zhǎng)(Khajuriaetal., 2010)。本文推測(cè)HaCHTⅠ和HaCHTⅣ可能對(duì)圍食膜均有影響，這可能與它們有相同的CBD有關(guān)。HaCHTⅦ對(duì)膠體幾丁質(zhì)就沒(méi)有幾丁質(zhì)降解活性，卻能將殼二糖降解成單糖(麥麥提艾力等，2019)，分析可能與其沒(méi)有CBD有關(guān)，這就為HaCHTⅦ在棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)起到將寡聚糖降解為單糖(N-乙酰基葡糖糖)提供了有力的證據(jù)，并為新幾丁質(zhì)的合成提供起始底物，參與昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。為此本研究采用qRT-PCR方法對(duì)棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因HaCHTI在棉鈴蟲(chóng)不同組織及幼蟲(chóng)中的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HaCHTI在棉鈴蟲(chóng)的各個(gè)組織中均高表達(dá)，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均有一個(gè)基礎(chǔ)水平的表達(dá)，表明HaCHTⅠ在棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育階段的蛻皮過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，在蛻皮前后的表達(dá)量變化很大，尤其是4齡和6齡蛻皮后的表達(dá)量很高，有可能此期發(fā)揮著更重的作用。據(jù)相關(guān)報(bào)道顯示赤擬谷盜的Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因TcCHT5在幼蟲(chóng)-成蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中高表達(dá)(Zhuetal., 2008)，但桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis中Ⅰ型幾丁質(zhì)酶基因BdCHT5在幼蟲(chóng)-蛹和蛹-成蟲(chóng)階段均有高表達(dá)，推測(cè)BdCHT5在幼蟲(chóng)-蛹和蛹-成蟲(chóng)變態(tài)過(guò)程中調(diào)控幾丁質(zhì)的降解(Liuetal., 2018)；家蠶Bombyxmori的I型幾丁質(zhì)酶BmCHT5在3齡幼蟲(chóng)蛻皮前開(kāi)始高表達(dá)，并且在蛻皮過(guò)程以及蛻皮后也高表達(dá)，蛻皮12 h后開(kāi)始消失(Kimetal., 1998)，后期研究發(fā)現(xiàn)，BmCHT5在5齡幼蟲(chóng)蛻皮前后以及化蛹期間表達(dá)較高，推測(cè)BmCHT5主要在該階段參與昆蟲(chóng)的蛻皮(Zhangetal., 2016)；美國(guó)白蛾Hyphantriacunea的I型幾丁質(zhì)酶基因HcCHT5在4齡幼蟲(chóng)蛻皮前(60 h)開(kāi)始高表達(dá)，并在蛻皮過(guò)程以及蛻皮后也高表達(dá)，蛻皮12 h后開(kāi)始降低(Kimetal., 1998)。棉鈴蟲(chóng)、赤擬谷盜、家蠶、美國(guó)白蛾均是全變態(tài)昆蟲(chóng)，綜合分析可以得出，HaCHTI可能在棉鈴蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中發(fā)揮著降解表皮幾丁質(zhì)成分的作用，以滿足棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的不斷生長(zhǎng)發(fā)育，這與前期對(duì)Ⅰ型幾丁質(zhì)酶功能的研究與報(bào)道是一致的，對(duì)棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因HaCHTVII在棉鈴蟲(chóng)不同組織及幼蟲(chóng)中的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析，HaCHTVII在頭殼和體壁中表達(dá)顯著高于其他組織，蛻皮前后表達(dá)量的變化較大，尤其是6齡末期和預(yù)蛹期的表達(dá)量相對(duì)很高，且本研究在飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由6齡末期到預(yù)蛹的過(guò)程中棉鈴蟲(chóng)的表皮和頭殼的變化較大，因此推測(cè)從幼蟲(chóng)到預(yù)蛹階段HaCHTⅦ可能對(duì)頭殼和體壁的變化發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)棉鈴蟲(chóng)I型和Ⅶ型幾丁質(zhì)酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)兩者具有相似的結(jié)構(gòu)域，唯一不同點(diǎn)在于I型比Ⅶ型多了一個(gè)CBD。兩種幾丁質(zhì)酶基因的時(shí)空表達(dá)也存在明顯的差異，其中HaCHTI在4齡初期和6齡末期的表達(dá)量顯著高于其他齡期，在各個(gè)組織中均有表達(dá)且沒(méi)有顯著性差異，因此推測(cè)HaCHTI參與其角質(zhì)層幾丁質(zhì)降解的更換過(guò)程，從而促進(jìn)舊表皮的降解及新表皮的生長(zhǎng)，以滿足棉鈴蟲(chóng)發(fā)育和變態(tài)需求；HaCHTVII在6末及預(yù)蛹時(shí)高表達(dá)，在頭殼和體壁中高表達(dá)，說(shuō)明HaCHTVII可能對(duì)棉鈴蟲(chóng)外骨骼系統(tǒng)中幾丁質(zhì)的形成具有重要作用。

在本研究中對(duì)幾丁質(zhì)酶基因HaCHTI和HaCHTVII只進(jìn)行了初步的比較分析，結(jié)合本課題組前期對(duì)這些酶底物研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HaCHTⅠ可以降解膠體幾丁質(zhì)，而HaCHTⅦ對(duì)降解膠體幾丁質(zhì)沒(méi)有降解活性，但其可將寡聚糖降解成單糖，可能為新的幾丁質(zhì)的合成提供起始底物，推測(cè)這可能與其沒(méi)有結(jié)構(gòu)域CBD有關(guān)。若對(duì)HaCHTⅠ和HaCHTⅦ進(jìn)行RNA干擾、抑制、突變等手段破壞酶活性，檢測(cè)其對(duì)圍食膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)、昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的影響，最終探明兩種幾丁質(zhì)酶的功能差異，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。