梁 焱，吳 華，韓日疇，曹 莉*

(1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225； 2. 廣東省科學(xué)院動物研究所，廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260)

冬蟲夏草是冬蟲夏草菌侵染寄主昆蟲-蝙蝠蛾科Hepialidae幼蟲，在合適環(huán)境下形成的幼蟲尸體與真菌子座的復(fù)合形態(tài)結(jié)構(gòu)(Sungetal.，2007；Loetal.，2013)。由于良好的藥理藥效作用，冬蟲夏草被稱為“中藥三大寶”(人參、鹿茸和冬蟲夏草)之一(Loetal.，2013；Gaoetal.，2014；Liuetal.，2015；丘雪紅等，2016；Zhangetal.，2017；Chenetal.，2018；韓日疇等，2019)。冬蟲夏草主要產(chǎn)于海拔3 000 m以上的青藏高原(Yietal.，2011)，生長周期長，生存條件惡劣，因此，野生資源極為有限(陳仕江等，2001)。隨著“亞健康”人群的擴(kuò)大，冬蟲夏草日益受到人們的青睞；而過度采挖和氣候變暖導(dǎo)致野生冬蟲夏草處于瀕危(Zhangetal.，2012；Lietal.，2016；Hoppingetal.，2018)。唯一選擇是進(jìn)行冬蟲夏草人工培育(Xiaetal.，2016；丘雪紅等，2016；韓日疇等，2019)。

冬蟲夏草菌是一種嗜低溫真菌(Dongetal.，2011；Dongetal.，2012)，其寄主蝙蝠蛾昆蟲野外完成其生活史需要3～4年，實(shí)驗(yàn)室培育也需要1～2年(徐海峰，2007；Taoetal.，2016；Lietal.，2020)。經(jīng)過數(shù)十年的努力，冬蟲夏草的人工栽培取得重大突破，包括冬蟲夏草菌子實(shí)體的人工培育(Caoetal.，2015)、蝙蝠蛾昆蟲低海拔規(guī)模化人工飼養(yǎng)(曹莉和韓日疇，2014；Taoetal.，2016；Lietal.，2019)以及利用冬蟲夏草菌感染蝙蝠蛾幼蟲獲得媲美野生的冬蟲夏草(張姝等，2013；Zhaoetal.，2014；Xiaoetal.，2018；韓日疇等，2019；Lietal.，2020)。目前，冬蟲夏草菌的芽生孢子和子囊孢子均用于感染蝙蝠蛾幼蟲獲得冬蟲夏草，芽生孢子用于注射感染(曹莉等，2019；Liuetal.，2020)，子囊孢子用于體表感染(楊大榮等，1986；韓曉然，2020)。在實(shí)踐中，兩種感染方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。注射感染時(shí)，需要獲得大量對蝙蝠蛾幼蟲具有高侵染力的芽生孢子(Liuetal.，2020)。

為了獲得高質(zhì)量的冬蟲夏草芽生孢子，本研究中比較了不同糖類培養(yǎng)基對冬蟲夏草菌芽生孢子產(chǎn)量以及芽生孢子對蝠蛾幼蟲存活率、攜菌率和僵蟲率的影響，為在低海拔地區(qū)人工栽培冬蟲夏草提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草菌培養(yǎng)

冬蟲夏草菌菌株KD(分離自四川康定)和QH(分離自青海玉樹)，經(jīng)分子鑒定后(Caoetal.，2015)保存于廣東省科學(xué)院動物研究所(原廣東省生物資源應(yīng)用研究所)。培養(yǎng)基成分如下：糖20 g，馬鈴薯200 g煮汁，蛋白胨10 g，大蠟螟鮮幼蟲5 g(以人工培養(yǎng)基飼養(yǎng))，磷酸二氫鉀3 g，七水合硫酸鎂1.5 g，維生素B10.02 g，以水定容至1 000 mL。配制好的培養(yǎng)基分裝至250 mL的三角瓶中，150 mL/瓶，并于121℃高壓滅菌30 min，冷卻后使用。本實(shí)驗(yàn)使用的糖類包括葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖，均為分析純，購自廣州市普博儀器有限公司。

于超凈工作臺中，將9～13℃下固體G5培養(yǎng)基(葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g煮汁，蛋白胨10 g，大蠟螟鮮幼蟲5 g(以人工培養(yǎng)基飼養(yǎng))，磷酸二氫鉀3 g，七水合硫酸鎂1.5 g，維生素B10.02 g，瓊脂16 g，以水定容至1 000 mL。)培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌塊(約1 cm3)接種于上述液體培養(yǎng)基中，置于110 rpm、9～13℃搖床上培養(yǎng)50 d，收集芽生孢子作為接種源。培養(yǎng)的菌液以三層無菌擦鏡紙過濾，收集濾液離心(8 000 rpm，10℃，15 min)，棄上清液，重懸于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)中。將收集的芽生孢子液稀釋至1.5×106個(gè)/mL，每瓶150 mL培養(yǎng)基中分別接入1 mL 1.5×106個(gè)/mL芽生孢子液，置于110 rpm、9～13℃搖床黑暗條件下培養(yǎng)。每隔10 d，分別從培養(yǎng)瓶中取樣0.3 mL，搖勻后取10 μL添加到等體積的熒光28染色劑(Sigma公司，上海)中對冬蟲夏草菌菌絲及芽生孢子進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡(Nikon，日本)下對芽生孢子進(jìn)行觀察與計(jì)數(shù)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，持續(xù)觀察至60 d。

1.2 蝙蝠蛾幼蟲的飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的小金蝠蛾6齡幼蟲 YL和GG品系于廣東省科學(xué)院動物研究所實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)方法按照(Taoetal.，2015)，6齡幼蟲用于注射感染。

1.3 蝠蛾幼蟲的侵染

以無菌PBS緩沖溶液稀釋收集得到的芽生孢子濃度為106個(gè)/mL。注射感染蝙蝠蛾幼蟲的方法按照(曹莉等，2019；Liuetal.，2020)。利用微量注射器(針頭直徑0.06 mm)分別對小金蝠蛾6齡幼蟲YL和GG品系進(jìn)行注射感染，每頭幼蟲注射4 μL芽生孢子(芽生孢子數(shù)量為106個(gè)/mL)。注射后的蝙蝠蛾幼蟲分別置于10℃、14℃或18℃中培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)60頭幼蟲，3個(gè)重復(fù)(共180頭)。于30 d觀察和記錄幼蟲存活率、于60 d觀察和記錄幼蟲存活率和幼蟲僵蟲率。

分別取注射后30 d的幼蟲血淋巴經(jīng)熒光28染色劑染色后，于顯微鏡下觀察血淋巴中是否出現(xiàn)芽生孢子，并計(jì)算幼蟲攜菌率。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)表示。使用SPSS軟件(IBM Statistics SPSS 25.0)分析。符合正態(tài)分布(Normality Plots with Tests)和方差齊性(Test of Homogeneity of Variances)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)；若方差存在顯著差異，則采用Tukey法進(jìn)行多重比較。對于不符合上述條件的數(shù)據(jù)則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test followed by the Mann-Whitney U test檢驗(yàn))。顯著水平設(shè)置為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖類對冬蟲夏草菌芽生孢子產(chǎn)量的影響

加入不同糖類的培養(yǎng)基中，冬蟲夏草菌(KD、QH菌株)在不同培養(yǎng)時(shí)間的芽生孢子產(chǎn)量不同(圖1、圖2)。含麥芽糖培養(yǎng)基中芽生孢子產(chǎn)量顯著高于其它糖類，果糖的產(chǎn)量最低；最佳產(chǎn)量處于培養(yǎng)時(shí)間30～40 d；其生長曲線大致分為3個(gè)階段：0～15 d的緩慢生長階段，15～35 d的指數(shù)生長階段，35～60 d的緩慢下降生長階段。

圖1 冬蟲夏草菌(KD菌株)9～13℃下于不同含糖培養(yǎng)基中芽生孢子生長曲線Fig.1 Growth curve of blastospores of Ophiocordyceps sinensis (KD) in the media containing different sugars at 9～13℃

圖2 冬蟲夏草菌(QH菌株)9～13℃下于不同含糖培養(yǎng)基中芽生孢子生長曲線Fig.2 Growth curve of blastospores of Ophiocordyceps sinensis (QH) in the media containing different sugars at 9～13℃

含糖不同的培養(yǎng)基中芽生孢子在30 d時(shí)的產(chǎn)量差異顯著(F11,24=414.719，P=0.000)(圖3)。KD菌株在不同培養(yǎng)基中的芽生孢子產(chǎn)量均顯著高于QH菌株；不論是在KD或QH菌株中，含麥芽糖培養(yǎng)基中芽生孢子產(chǎn)量均顯著高于其它糖類；對于KD菌株，含阿拉伯糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中芽生孢子產(chǎn)量無顯著差異，但顯著高于含果糖、蔗糖和海藻糖培養(yǎng)基中的孢子產(chǎn)量；含海藻糖培養(yǎng)基中收獲的芽生孢子數(shù)量顯著高于含果糖和蔗糖培養(yǎng)基的，蔗糖和果糖間差異不顯著。對于QH菌株，含阿拉伯糖培養(yǎng)基中芽生孢子產(chǎn)量顯著高于含葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖培養(yǎng)基的；含葡萄糖、果糖、蔗糖或海藻糖培養(yǎng)基中芽生孢子數(shù)量差異不顯著。因此，麥芽糖是支持冬蟲夏草菌芽生孢子生長的最優(yōu)糖源；KD菌株芽生孢子在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)量均高于QH菌株。

圖3 兩種冬蟲夏草菌株(KD和QH)9～13℃下于不同糖類培養(yǎng)基中30 d的芽生孢子產(chǎn)量Fig.3 Yields of Ophiocordyceps sinensis blastospores(KD and QH)in the media containing different sugars at 30 d at 9～13℃注：柱子上面不同字母表示處理間芽生孢子產(chǎn)量在5%水平差異顯著，下同。 Note:Columns with different letters indicate significant differences at 5% level among the yields of blastospores. The same as below.

2.2 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲存活率、攜菌率及僵蟲率的影響

含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的芽生孢子(KD、QH菌株)以106個(gè)/mL濃度注射小金蝠蛾幼蟲的兩個(gè)品系，被注射幼蟲置于10℃下飼養(yǎng)30 d的存活率、攜菌率，60 d的僵蟲率見圖4～6(KD、QH菌株的含果糖培養(yǎng)基及QH菌株的含葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d達(dá)不到注射濃度)。含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的芽生孢子(KD菌株)注射后幼蟲的存活率(圖4-A)不存在顯著差異(F9,20=0.966,P=0.495)，而QH菌株(圖4-B)的存活率存在顯著差異(F5,12=4.089,P=0.021)，海藻糖的YL品系幼蟲存活率顯著低于阿拉伯糖、麥芽糖(YL和GG品系)及海藻糖GG品系的。其攜菌率均存在顯著差異(KD菌株，圖5-A：H=19.483,P=0.021; QH菌株，圖5-B:H=11.940,P=0.036)，KD菌株含麥芽糖培養(yǎng)基(YL及GG品系幼蟲)和含海藻糖培養(yǎng)基的YL品系幼蟲攜菌率達(dá)到100%，而QH菌株僅有含麥芽糖培養(yǎng)基的GG品系幼蟲攜菌率達(dá)到100%。其僵蟲率均存在顯著差異(KD菌株，圖6-A：F9,20=7.711,P=0.000; QH菌株，圖6-B：F5,12=4.160,P=0.020)。

2.3 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d的冬蟲夏草菌芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲存活率、攜菌率及僵蟲率的影響

含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d的芽生孢子(KD、QH菌株)以106個(gè)/mL濃度注射兩個(gè)品系的小金蝠蛾幼蟲，被注射幼蟲置于10℃下飼養(yǎng)30 d的存活率、攜菌率，60 d的僵蟲率見圖7～圖9。含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的芽生孢子(KD、QH菌株)注射后幼蟲的存活率(圖7-A、圖7-B)均不存在顯著差異(KD菌株：H=15.328，P=0.168；QH菌株：F11,24=1.695,P=0.135)。其攜菌率(圖8-A、圖8-B)也不存在顯著差異(KD菌株：H=14.842,P=0.190; QH菌株：H=18.868,P=0.063)。KD菌株的僵蟲率(圖9-A)也不存在顯著差異(H=12.751,P=0.310)，而QH菌株(圖9-B)的僵蟲率存在顯著差異(H=21.870,P=0.025)。

圖4 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)存活率的影響Fig.4 Survival rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 30 days

圖5 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)攜菌率的影響Fig.5 Fungal retention rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 30 days

圖6 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)僵蟲率的影響Fig.6 Mummified rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 30 days

圖7 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)存活率的影響Fig.7 Survival rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 45 days

圖8 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)攜菌率的影響Fig.8 Fungal retention rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 45 days

圖9 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)45 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)僵蟲率的影響Fig.9 Mummified rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 45 days

2.4 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲存活率、攜菌率及僵蟲率的影響

含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的芽生孢子(KD、QH菌株)以106個(gè)/mL濃度注射兩個(gè)品系的小金蝠蛾幼蟲，被注射幼蟲置于10℃下飼養(yǎng)30 d的存活率、攜菌率，60 d的僵蟲率見圖10～圖12(QH菌株的含阿拉伯糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d所剩芽生孢子不夠注射使用量)。含不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的芽生孢子(KD、QH菌株)注射后幼蟲的存活率(圖10-A、圖10-B)均不存在顯著差異(KD菌株：F11,24=2.091，P=0.063；QH菌株：H=15.403,P=0.080)。KD菌株的攜菌率(圖11-A)存在顯著差異(KD菌株：H=23.589,P=0.015)，其中YL品系幼蟲中麥芽糖、蔗糖和海藻糖的攜菌率達(dá)到100%，GG品系幼蟲中果糖、阿拉伯糖和麥芽糖的攜菌率達(dá)到100%。而QH菌株含不同糖培養(yǎng)基的攜菌率(圖11-B)差異不顯著(H=13.677,P=0.134)。其僵蟲率均存在顯著差異(KD菌株，圖12-A：H=25.545,P=0.008；QH菌株，圖12-B：H=23.587,P=0.005)。

圖10 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)存活率的影響Fig.10 Survival rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 60 days

圖11 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)攜菌率的影響Fig.11 Fungal retention rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 60 days

圖12 不同糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌KD(A)、QH(B)芽生孢子對注射后的小金蝠蛾幼蟲(YL、GG品系)僵蟲率的影響Fig.12 Mummified rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae challenged with Ophiocordyceps sinensis (KD and QH) blastospores from the media containing different sugars after 60 days

2.5 含麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的冬蟲夏草菌對蝙蝠蛾幼蟲存活率的影響

含麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間的芽生孢子(KD和QH菌株)以106個(gè)/mL濃度注射小金蝠蛾幼蟲的兩個(gè)品系，被注射幼蟲置于10℃、14℃和18℃下飼養(yǎng)30 d的存活率見表1。在同一溫度下，無論是注射培養(yǎng)30 d、45 d、60 d的KD還是QH菌株，兩個(gè)蝙蝠蛾品系的幼蟲于30 d的存活率均無顯著差異(表1)，即30 d：(10℃，F(xiàn)3,8=0.966，P=0.454；14℃，F(xiàn)3,8=1.109，P=0.401；18℃，F(xiàn)3,8=1.594，P=0.266)、45 d：(10℃，F(xiàn)3,8=0.664，P=0.597；14℃，F(xiàn)3,8=2.446，P=0.139；18℃，F(xiàn)3,8=1.411，P=0.309)、60 d：(10℃，F(xiàn)3,8=0.401，P=0.756；14℃，F(xiàn)3,8=3.612，P=0.065；18℃，F(xiàn)3,8=1.618，P=0.260)。在其它條件相同下，不同溫度間的蝙蝠蛾幼蟲于30 d后的存活率部分存在顯著差異(表2)。10℃下的蝙蝠蛾幼蟲存活率優(yōu)于14℃、18℃的；不同芽生孢子培養(yǎng)時(shí)間對注射后的蝙蝠蛾幼蟲在10℃、14℃、18℃下于30 d的存活率存在差異(10℃：F2,33=9.820，P=0.000；14℃：F2,33=12.793，P=0.000；18℃：F2,33=26.403，P=0.000)，30 d的芽生孢子培養(yǎng)時(shí)間對注射后的蝙蝠蛾幼蟲存活率顯著優(yōu)于60 d的。因此，不同冬蟲夏草菌株未顯著影響在相同飼養(yǎng)溫度下的兩種小金蝠蛾品系的存活率；但不同飼養(yǎng)溫度或不同芽生孢子的收獲時(shí)間顯著影響兩種小金蝠蛾幼蟲的存活率。

表1 含麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d、45 d、60 d的冬蟲夏草菌(KD和QH菌株)注射小金蝠蛾幼蟲(YL和GG品系)在不同溫度下的存活率

2.6 含麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的冬蟲夏草菌對蝙蝠蛾幼蟲僵蟲率的影響

結(jié)果分析表明含麥芽糖的冬蟲夏草菌(KD、QH)注射蝙蝠蛾幼蟲(YL和GG)在10℃的僵蟲率顯著高于14℃、18℃(表3)，14℃和18℃下所有幼蟲的僵蟲率為0。不同時(shí)間收獲的冬蟲夏草菌(KD菌株)芽生孢子注射的小金蝠蛾幼蟲的僵蟲率間存在顯著差異(F5,12=6.340，P=0.004)(圖13)；培養(yǎng)30 d的冬蟲夏草菌(KD)芽生孢子注射的小金蝠蛾幼蟲YL品系的僵蟲率與培養(yǎng)60 d的芽生孢子無顯著差異，但培養(yǎng)30 d的芽生孢子注射的小金蝠蛾幼蟲GG品系的僵蟲率顯著高于培養(yǎng)60 d芽生孢子的；而培養(yǎng)30 d和45 d的芽生孢子注射的兩種小金蝠蛾幼蟲品系的僵蟲率之間未見顯著差異(圖13)。

表2 含麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d、45 d、60 d的冬蟲夏草菌(KD和QH菌株)注射小金蝠蛾幼蟲(YL和GG品系)在不同溫度下的存活率方差分析結(jié)果

表3 小金蝠蛾幼蟲(YL和GG品系)被注射麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d、45 d、60 d的冬蟲夏草菌(KD和QH菌株)芽生孢子后于10℃、14℃、18℃下60 d的僵蟲率

圖13 小金蝠蛾幼蟲(YL和GG品系)被注射麥芽糖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d、45 d、60 d的冬蟲夏草菌(KD菌株)芽生孢子后于10℃下60 d的僵蟲率Fig.13 Mummified rates of the Thitarodes xiaojinensis (YL and GG) larvae at 60 days at 10℃ after challenged with 30 d、45 d and 60 d old Ophiocordyceps sinensis (KD) blastospores cultured with the medium containing maltose

3 結(jié)論與討論

冬蟲夏草菌是寄生于蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的一種藥用真菌(劉麗娟等，2004；董彩虹等，2016)。冬蟲夏草菌入侵其寄主蝠蛾幼蟲的相關(guān)機(jī)制尚未明了(Mengetal.，2015；Raoetal.，2019)。體表、針刺、涂抹、喂食、浸泡、噴霧等方法常用于感染蝙蝠蛾幼蟲(楊大榮等，1986；王忠等，2001；廖志勇，2005；涂永勤等，2010a)，但是仍存在攜菌率低、死亡率高及僵蟲率低等問題(韓日疇等，2019)。Liu等(2020)采用微注射芽生孢子感染蝙蝠蛾幼蟲的方法，極大地提高了幼蟲攜菌率。

不同真菌所需的最佳糖源不同，如蛹蟲草Cordycepsmilitaris的最佳糖源為蔗糖(楊心如等，2019；楊婷婷，2019)；雙孢蘑菇Agaricusbisporus的最佳糖源為麥芽糖(張倢，2016)；劉永霞(2004)認(rèn)為冬蟲夏草菌菌絲生長的最佳糖源為葡萄糖；王爽等(2013)研究表明葡萄糖或麥芽糖對球孢白僵菌Beauveriabassiana的生長和產(chǎn)孢明顯優(yōu)于其它糖源。趙秀芳(2005)認(rèn)為白靈菇Pleurotusnebrodensis菌絲生長的最適糖源是麥芽糖和蔗糖，而牛宇等(2019)表明白靈菇菌絲生長的最佳糖源為葡萄糖、麥芽糖，以甘露醇和可溶性淀粉為糖源時(shí)發(fā)酵液中獲得的菌絲干重最大。本次研究結(jié)果顯示含不同糖類的培養(yǎng)基對冬蟲夏草菌芽生孢子產(chǎn)量存在顯著差異，其中麥芽糖為最優(yōu)糖源；然而，芽生孢子生長對糖類的最優(yōu)選擇并不等于子實(shí)體生長的糖選擇，含葡萄糖的大米小麥培養(yǎng)基中冬蟲夏草子實(shí)體的生長速率和干重明顯優(yōu)于含麥芽糖培養(yǎng)基的(陶海平等，2020)。

王忠等(2001)表明蝙蝠蛾幼蟲的飼養(yǎng)溫度應(yīng)該控制在6～12℃，而王宏生(2002)則認(rèn)為蝙蝠蛾幼蟲的最佳飼養(yǎng)溫度為10～15℃。被冬蟲夏草菌感染后的蝙蝠蛾幼蟲，在不同的溫度、濕度和不同的光照條件下，其子實(shí)體形成也存在差異(李少松，2009；涂永勤等，2010b)。曹莉等(2019)研究表明，4℃左右低溫可以刺激被冬蟲夏草菌感染后的蝙蝠蛾幼蟲子實(shí)體形成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10℃較14℃、18℃適合小金蝠蛾幼蟲的生存，而高溫大大降低小金蝠蛾幼蟲的僵蟲率，甚至導(dǎo)致其死亡率升高。需要指出，本研究主要是測定不同參數(shù)培養(yǎng)的冬蟲夏草芽生孢子對小金蝠蛾存活率和僵蟲率的影響，所獲結(jié)果顯示注射不同冬蟲夏草菌株未顯著影響在相同飼養(yǎng)溫度下的兩種小金蝠蛾品系的存活率和僵蟲率，不同飼養(yǎng)溫度或不同芽生孢子的收獲時(shí)間顯著影響兩種小金蝠蛾幼蟲的存活率和僵蟲率，但是獲得的蝙蝠蛾幼蟲存活率和僵蟲率并非最優(yōu)。

本實(shí)驗(yàn)中注射分離自四川和青海的冬蟲夏草菌株均未顯著影響在相同飼養(yǎng)溫度下的小金蝠蛾兩個(gè)品系的存活率，說明菌株和寄主昆蟲之間未必存在明顯的?；?，但需要在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。不同芽生孢子的收獲時(shí)間顯著影響小金蝠蛾兩個(gè)品系幼蟲的存活率和僵蟲率，具體原因仍有待研究。目前未見有不同時(shí)間收獲的冬蟲夏草菌芽生孢子注射蝙蝠蛾幼蟲的報(bào)道。不同糖代謝過程形成的芽生孢子顯著影響其與寄主昆蟲相關(guān)作用的機(jī)理值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)的幼蟲存活率比較低，可能與注射的幼蟲齡期有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)30～45 d的冬蟲夏草菌收集的芽生孢子為注射感染小金蝠蛾幼蟲的最佳芽生孢子，而培養(yǎng)60 d的冬蟲夏草菌芽生孢子似乎老化，有可能降低僵蟲率。

本研究結(jié)果為培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)冬蟲夏草芽生孢子，提高被侵染蝙蝠蛾幼蟲存活率、攜菌率和僵蟲率提供了參考。