胡仕婕， 趙 洋， 馮藝川， 李子羊， 全雪麗， 吳松權(quán)*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.百泰生物藥業(yè)有限公司，北京 100176)

黃芪(Radix Astragali)具有補(bǔ)氣固表、利尿消腫、托毒生肌之功效，在傳統(tǒng)中藥與臨床醫(yī)學(xué)中已被普遍應(yīng)用，素有“十藥八芪”之稱[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪能夠預(yù)防感冒、肺結(jié)核盜汗、慢性肝炎、增加腎血流量、減輕腎損傷、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧及應(yīng)激能力等癥[2-4]。其中，膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge)及其變種蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge)Hsiao)被確定為中藥黃芪，其他黃芪作為黃芪代用品或地方性用品[5-7]。芒柄花素(Formononetin)屬于甲基化的異黃酮類化合物，是黃芪最具活性的主要成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗心率不齊、抗菌、降血脂、改善動(dòng)脈粥樣硬化病變和雌性激素樣作用等多種作用[8]。

膜莢黃芪是長(zhǎng)白山區(qū)道地藥材之一，由于市場(chǎng)上對(duì)于膜莢黃芪需求的急劇增加，使得長(zhǎng)白山區(qū)野生膜莢黃芪供不應(yīng)求。雖然大規(guī)模的人工栽培黃芪使其得到了較好地補(bǔ)充，但栽培黃芪無(wú)論外觀品質(zhì)還是成分含量均遠(yuǎn)低于野生黃芪。異黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Isoflavone O-methyltransferase，IOMT)屬于FOMT基因家族的一員，在毛蕊異黃酮葡萄糖苷生物合成中將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到大豆苷元(Daidzein)生成芒柄花素，是其生物合成的關(guān)鍵基因。因此，該研究以長(zhǎng)白山膜莢黃芪為試材，克隆AmIOMT基因的全長(zhǎng)序列，探究其在膜莢黃芪不同組織中的表達(dá)特性，為分子水平上了解芒柄花素的生物合成機(jī)制和調(diào)控規(guī)律奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪藥材源自長(zhǎng)白山區(qū)野生膜莢黃芪，經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室石鐵源教授鑒定為膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

植物材料的處理參見王樹斌等[9]的方法，種植于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地。精確稱取根、莖、葉的新鮮部分0.5 g，各3份，液氮速凍后置于-70 ℃超低溫保存箱中保存，用于總RNA提??；另取根、莖、葉的新鮮部分0.5 g，各3份，于50 ℃烘干箱中烘干至恒重后磨粉，過60目篩，用于芒柄花素的提取。

1.2 方法

1.2.1 膜莢黃芪總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

膜莢黃芪總RNA的提取參照郎紅[10]方法，嚴(yán)格按照TRIzol試劑說明書所提供的步驟操作。將所得總RNA使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，分析其純度及濃度；隨后將總RNA稀釋至濃度為500 ng/μL，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以膜莢黃芪總RNA 500 ng/μL稀釋液為反轉(zhuǎn)錄模板，嚴(yán)格按照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說明書所提供的步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA以及后續(xù)5′-RACE與3′-RACE擴(kuò)增，過程擴(kuò)增產(chǎn)物貯存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2 膜莢黃芪AmIOMT基因全長(zhǎng)克隆

登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已登錄的擬南芥或者大豆、苜蓿等豆科模式植物甲基轉(zhuǎn)移酶與糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，用MEGA 6軟件對(duì)其進(jìn)行多重序列比對(duì)，分析并確定其保守區(qū)域；使用Primer Premier5.1軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物AmIOMT ju1和AmIOMT jd1(表1)并擴(kuò)增。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1) 擴(kuò)增體系 cDNA1.0 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、dNTP Mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL、Ex Taq(2.5 U/μL) 0.4 μL、2.0 μmol/L引物各2.0 μL, 終體積為20.0 μL。

2) 反應(yīng)條件 94 ℃預(yù)變性5 min; 然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 94 ℃ 40 s,52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 程序循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸反應(yīng)10 min。

依據(jù)擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5′-RACE擴(kuò)增特異引物AmIOMT gsp1與3′-RACE擴(kuò)增特異引物AmIOMT gsp2(表1)，并進(jìn)行5′-RACE與3′-RACE擴(kuò)增；依據(jù)已克隆的AmIOMT基因的保守序列及5′-RACE和3′-RACE產(chǎn)物序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接，了解目的基因cDNA全長(zhǎng)序列信息，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)了CDS特異引物AmIOMT cu1與AmIOMT cd1(表1)擴(kuò)增AmIOMT基因的ORF，驗(yàn)證目的基因的編碼序列。所有過程PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后使用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit進(jìn)行回收，連接到PMD-18T載體，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性克隆菌株送測(cè)序。

1.2.3膜莢黃芪AmIOMT基因的生物信息學(xué)分析

NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast同源性搜索分析；編碼蛋白等電點(diǎn)和分子量預(yù)測(cè)采用ExPasy在線軟件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)；疏水性運(yùn)用ExPASy ProtScale在線軟件(http://expasy.org/tools/protscale.html)；亞細(xì)胞定位情況分別用TargetP1.1(http://cbs.dtu.dk/services/TargetP)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別使用PBIL LYON-GERLANG數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss-Model (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)在線工具完成；利用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析其在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 膜莢黃芪AmIOMT基因的表達(dá)量分析

1.2.4.1 膜莢黃芪不同時(shí)期總RNA的提取與cDNA的合成

具體方法參照2.1步驟，對(duì)膜莢黃芪不同部位樣品進(jìn)行總RNA的提取與cDNA的合成，稀釋1倍后保存于-20℃冰箱中待用。

1.2.4.2AmIOMT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1) 用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得AmIOMT的CDS質(zhì)粒濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算其拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)/copy·μL-1=樣品濃度/ng·μL-1/樣品分子量×6.02E+14

2) 將質(zhì)粒原液10×等梯度稀釋至不同濃度，用作模板實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品重復(fù)6次。具體反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、cDNA 2.0 μL、Premix (2.0 μM) 2.0 μL，終體積20.0 μL。

3) 將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得Ct值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的質(zhì)粒濃度為橫坐標(biāo)，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 18 s內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與模板定量

1) 18 s內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以2.4.1步驟所得膜莢黃芪cDNA為模板，通過PCR克隆18s內(nèi)參基因(表1)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法具體參照2.4.2步驟。

2) 18 s內(nèi)參基因模板定量

以2.4.1步驟中制備的cDNA為模板，用18 s定量引物(表1)對(duì)不同部位的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所得Ct值通過18 s標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算拷貝數(shù)，即為18 s內(nèi)參基因的表達(dá)量。

1.2.4.4AmIOMT基因在膜莢黃芪不同器官中表達(dá)量分析

以2.4.1步驟中制備的cDNA為模板，使用AmIOMT定量引物(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，將基因在不同時(shí)期未知樣品所得Ct值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出拷貝數(shù)。最終拷貝數(shù)與18 s內(nèi)參基因表達(dá)量的比值即基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)4次。

1.2.5 膜莢黃芪芒柄花素含量的測(cè)定

膜莢黃芪不同部位芒柄花素的提取采用 HPLC 法[11]對(duì)膜莢黃芪根、莖和葉等樣品進(jìn)行測(cè)定，重復(fù) 3 次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，個(gè)體差異利用Duncan多范圍檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估(P<0.05)用標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)代表誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜莢黃芪AmIOMT基因克隆及序列分析

以膜莢黃芪cDNA為模板，使用簡(jiǎn)并引物AmIOMT ju1與AmIOMT jd1擴(kuò)增AmIOMT基因的保守區(qū)，經(jīng)切膠回收、T載體連接、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109菌株后，獲得重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1(A和B)所示。AmIOMT基因保守區(qū)目的片段長(zhǎng)度為400 bp左右，測(cè)序結(jié)果顯示，AmIOMT基因保守區(qū)目的片段長(zhǎng)度為417 bp。

登錄NCBI主頁(yè)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用Blast在線搜索工具，將所得的AmIOMT保守區(qū)目的片段與其他植物的基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示：AmIOMT保守區(qū)目的片段與豆科植物紅豆草(HM204486)、蒺藜苜蓿(DQ419911)和大豆(KM012508.1)基因的一致性分別為86%、85%和85%；故初步認(rèn)為所克隆的AmIOMT保守區(qū)目的片段為膜莢黃芪IOMT基因片段。

使用膜莢黃芪總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第1條鏈，使用表1示出的特異引物AmIOMT gsp1、AmIOMT gsp2以及引物UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)分別進(jìn)行5′-RACE和3′RACE擴(kuò)增，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1(C、D、E和F)所示，可見鑒定結(jié)果與PCR產(chǎn)物一致，可將菌液保存并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，AmIOMT5′端序列長(zhǎng)度為1 050 bp，同源性搜索表明，該序列與豆科植物紅豆草(HM204486)、甘草(AB091685)、紫花苜蓿(MSAF000976)和蒺藜苜蓿(AY942159.1)的序列一致性分別為83%、82%、79%和79%；AmIOMT3′端序列長(zhǎng)度為477 bp，該序列與豆科植物紅豆草(HM204486)、甘草(AB091685)、紫花苜蓿(MSAF000976)和蒺藜苜蓿(AY942159.1)的序列一致性分別為85%、83%、82%和84%。因此，初步認(rèn)定AmIOMT5′端與AmIOMT-3′端分別為膜莢黃芪IOMT基因的5′端和3′端。

依據(jù)測(cè)序所得AmIOMT基因保守區(qū)域以及5′-RACE和3′-RACE序列，通過DNAStar軟件拼接獲得AmIOMT基因的全長(zhǎng)序列，利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)1對(duì)編碼區(qū)特異引物(表1)。以1.2.1步驟所得cDNA第1條鏈為模板，通過PCR擴(kuò)增獲取目的基因片段，經(jīng)過回收、連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1(G和H)所示。因此，PCR鑒定與拼接所得序列一致，故確定AmIOMT基因的全長(zhǎng)序列。

M:DL 2 000 Marker 1：目的條帶圖1 RACE法克隆AmUCGT基因電泳及PCR檢測(cè)圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of AmIOMT cloning by RACE

利用DNAStar序列分析軟件和NCBI網(wǎng)站的 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)等在線分析工具分析AmIOMT全長(zhǎng)cDNA序列。結(jié)果顯示(圖2)，AmIOMT序列全長(zhǎng)1 213 bp，其中，開放閱讀框(ORF)1 089 bp，預(yù)測(cè)其編碼362個(gè)氨基酸多肽，此外，包含5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)為54 bp，3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)為70 bp(含24 bp的polyA尾)；A+T的含量為65.2%，G+C的含量為34.8%。登錄NCBI使用Blast在線搜索工具，將所得的膜莢黃芪IOMT基因序列其他植物的基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，AmIOMT與豆科植物紫花苜蓿(AF023481.1)、蒺藜苜蓿(AY942159.1)、紅豆草(HM204486.1)以及大豆(AB091685.1)的序列一致性分別為85%、84%、83%和82%。此外，與其他豆科植物的一致性也很高，初步說明該研究所克隆的AmIOMT是膜莢黃芪的甲基轉(zhuǎn)移酶序列。

圖2 AmIOMT基因全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The full length sequence and deduced amino acid sequences of AmIOMT

2.2 膜莢黃芪AmIOMT基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam在線分析工具預(yù)測(cè)AmIOMT蛋白質(zhì)的分子式為C1821H2881N461O548S20，蛋白分子量(MW)為40.64 kDa，所有氨基酸殘基中，Leu(11.0%)、Ile(8.3%)、Glu(8.3%)和Lys(8.0%)頻率較高；理論等電點(diǎn)(pI)為4.95，帶負(fù)電荷殘基數(shù)54，帶正電荷殘基數(shù)35，表明該蛋白呈酸性狀態(tài)；不穩(wěn)定系數(shù)36.60，屬穩(wěn)定性蛋白；親水性均值-0.052，屬親水性蛋白。

使用PRABI在線分析軟件與Swiss-Model Workspace在線工具預(yù)測(cè)AmIOMT二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，AmIOMT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋174個(gè)，無(wú)規(guī)則卷曲137個(gè)以及鏈延伸區(qū)51個(gè)，分別占據(jù)47.93%、37.74%和14.05%，與三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致；對(duì)保守域分析表明，該蛋白存在IOMT受體結(jié)合域(又稱類黃酮底物結(jié)合域)和供體結(jié)合域(SAM結(jié)構(gòu)域)。采用TMHMM 2.0在線分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，AmIOMT蛋白不存在跨膜區(qū)域，是非跨膜蛋白。

2.3 膜莢黃芪AmIOMT基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)一步深入研究AmIOMT與其他物種中甲基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化關(guān)系，通過MEGA6軟件利用最大近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將所選取不同物種的甲基轉(zhuǎn)移酶分為3組，在圖中分別以組I、II、III示出。其中，組I中成員已被鑒定具有異黃酮7-O甲基轉(zhuǎn)移酶或類似活性，組Ⅱ中已被鑒定具有異黃酮4’-O甲基轉(zhuǎn)移酶或類似活性，組Ⅲ代表其他類別的甲基轉(zhuǎn)移酶。AmIOMT在組I中與豆科植物甘草中GeD7OMT與紅豆草中OvIOMT聚為一組，GeD7OMT與OvIOMT已均為已知功能的異黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶，初步表明所鑒定的AmIOMT具有異黃酮7-O甲基化的能力。

注：GeneBank登錄號(hào)：MsI7OMT8(紫花苜蓿，O24529.1)；MsI7OMT9(紫花苜蓿，O22309.1)；MsI7OMT6(紫花苜蓿，O22308.1)；MtIOMT1(蒺藜苜蓿，XP_003621488.2)；CaI7OMT9(鷹嘴豆，XP_004489528.1)；GeD7OMT(甘草，Q84KK5.1)；OvIOMT(紅豆草，AEF14418.1)；MtIOMT6(蒺藜苜蓿，XP_013455257.1)；VrI4OMT(綠豆，XP_014524149.1)；GeHI4OMT(甘草，Q84KK6.1)；MtIOMT5(蒺藜苜蓿，XP_013456930.1)；PsHMM1(豌豆，O24305.1)；CaCCOMT(鷹嘴豆，XP_004505242.1)；MsCOMT(紫花苜蓿，Q40313.1)；MsCCOMT(紫花苜蓿，XP_003607927.1)；MfCCOMT(黃花苜蓿，AEW26114.1)圖3 植物甲基轉(zhuǎn)移酶基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of plant O-methyltransferase genes

2.4 AmIOMT在膜莢黃芪不同器官的差異表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)估AmIOMT在膜莢黃芪不同器官中的表達(dá)(圖4)，結(jié)果表明，AmIOMT在膜莢黃芪的根、莖和葉中均表達(dá)且達(dá)到了顯著水平。其中，葉中AmIOMT表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的23.1倍，而莖中AmIOMT的表達(dá)量為根中表達(dá)量的9.4倍，而通過HPLC法測(cè)定膜莢黃芪不同器官中芒柄花素含量結(jié)果(圖4)表明：葉中含量是根中含量(0.012 mg/g)的12.1倍，達(dá)到0.146 mg/g；莖中含量為0.084 mg/g，是根的7.0倍。

圖4 不同器官中AmIOMT基因的表達(dá)與芒柄花素含量Fig.4 Expression levels of AmIOMT and formononetin contents in different organs of A.membrananceus

3 討論與結(jié)論

芒柄花素是黃芪主要藥用成分之一[8]，但對(duì)作為芒柄花素生物合成中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因IOMT的相關(guān)報(bào)道較少。該研究成功從長(zhǎng)白山區(qū)膜莢黃芪根中克隆了AmIOMT基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1 213 bp，包含1 089 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼362個(gè)氨基酸多肽，為可溶性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中。這與前人研究認(rèn)為在自然界中，黃酮類化合物廣泛存在的一類多酚化合物[12]，具有極高的藥用價(jià)值[13]。通常在細(xì)胞質(zhì)中合成，其生物合成相關(guān)基因以多酶復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[14]結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AmIOMT在與豆科植物甘草中GeD7OMT與紅豆草中OvIOMT聚為一組，GeD7OMT與OvIOMT已均為已知功能的7-O異黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶，Akashi等[15]報(bào)道了GeD7OMT涉及芒柄花素(Formononetin)的生物合成，Thill等[16]則報(bào)道OvIOMT可以在7-O位置甲基化異黃酮。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，克隆的AmIOMT具備甲基轉(zhuǎn)移酶典型的結(jié)構(gòu)特征和生物特性，即已成功克隆得到的AmIOMT基因全長(zhǎng)cDNA序列具備7-O甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到大豆苷元生成芒柄花素的能力。

植物次生代謝產(chǎn)物受基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)水平等方面因素的綜合調(diào)控[8]。植物次生代謝產(chǎn)物的積累通常與其生物合成途徑基因的表達(dá)密切相關(guān)。因此，為了進(jìn)一步明確膜莢黃芪AmIOMT基因與芒柄花素生物合成的分子機(jī)制，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)評(píng)估了AmIOMT基因在膜莢黃芪不同器官中的表達(dá)量與芒柄花素含量之間的關(guān)系。經(jīng)過分析，AmIOMT基因在膜莢黃芪各個(gè)器官中的表達(dá)與芒柄花素含量之間均表達(dá)均，呈逐步升高的折線趨勢(shì)(圖4)，即均為葉>莖>根，說明芒柄花素的生物合成可能直接受到AmIOMT基因的調(diào)控。但黃酮類的生物合成是極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通常受到多種因素的綜合誘導(dǎo)和影響，而其在翻譯后蛋白質(zhì)水平的調(diào)控尚不明確，需要進(jìn)一步的深入研究。