馬縱橫， 崔銘洋， 胡 楠， 羅廣軍*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000)

20世紀(jì)60～70年代，我國農(nóng)業(yè)氮肥施用量驟然上升，截止2013年，中國已是世界上最大的氮肥生產(chǎn)和消費(fèi)國家，分別占世界總量的60%和52%[1]。氮肥的過度施用破壞了自然界中氮素的平衡，影響生物圈氮素循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[2-3]。植物營養(yǎng)分析和農(nóng)業(yè)生長實(shí)踐表明，過多施用氮肥不能增加產(chǎn)量，反而造成土壤板結(jié)和內(nèi)源氮素的過量流失[4-5]。無效施肥即過量施肥與農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和環(huán)境之間的關(guān)系已經(jīng)成為當(dāng)今中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在的主要矛盾[6-7]。

氮是蛋白質(zhì)的主要成分，蛋白質(zhì)含氮量在15%～18%。蛋白質(zhì)又是組成生物體的基礎(chǔ)物質(zhì)，生命現(xiàn)象中起到主要承載和執(zhí)行作用。葉綠素是植物光合作用中重要的捕光色素，對(duì)植株的關(guān)鍵性生命活動(dòng)具有重要的意義。由于N素在植物體內(nèi)極易移動(dòng)，在植株缺乏氮素供應(yīng)時(shí)，N素會(huì)從老的組織中轉(zhuǎn)運(yùn)到幼嫩組織中，從而加速葉的衰老。因此，氮脅迫會(huì)影響葉片發(fā)育，減少葉面積，進(jìn)而使植株光合作用降低；同時(shí)，葉綠素的合成途徑受阻，葉綠素含量減少，葉片黃化；植株生長減緩，產(chǎn)量降低[8-11]。

近幾年，人們逐漸意識(shí)到過度施用氮肥已成為制約環(huán)境保護(hù)順利開展的關(guān)鍵因素之一。如何在減少氮肥施用的同時(shí)，又能夠充分發(fā)揮氮素在林木生長發(fā)育過程中的作用，達(dá)到減施不減產(chǎn)質(zhì)的效果，是目前關(guān)注的焦點(diǎn)問題。隨著研究的不斷深入，利用植株本身對(duì)不同養(yǎng)分脅迫耐受性的差異來進(jìn)行篩選優(yōu)異材料，提高材料的氮素利用效率，是該研究關(guān)心的科學(xué)問題之一。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗(yàn)以5年生文冠果112個(gè)實(shí)生后代和母樹的扦插苗作為試驗(yàn)材料，2012年春季播種，2017年選擇半木質(zhì)化新梢進(jìn)行綠枝扦插，扦插方法參照金香花等[12]人的方法， 扦插生根50 d后移栽水培處理，30 d后進(jìn)行脅迫處理。篩選的優(yōu)系命名為氮素高效利用(Nitrogen Efficient, NE)，母樹(MS)作為對(duì)照材料。

1.2 方法

低氮脅迫采用0.2 mmol/L氮營養(yǎng)液，對(duì)照組為完全培養(yǎng)液。在脅迫處理15、30、45、60 d后，利用米尺和游標(biāo)卡尺測定植株的株高、莖粗、新梢長度，分光光度計(jì)測定葉綠素含量、SOD、POD酶活以及MDA含量[13]，使用便攜式光合測定儀測定凈光合速率、蒸騰速率生理指標(biāo)[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Student’st測驗(yàn)分析成對(duì)樣本，采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮高效利用文冠果的篩選

伴隨著低氮脅迫處理時(shí)間的延長，植物會(huì)表現(xiàn)出葉片變小且老葉部分或全部變黃的外觀特征，進(jìn)而造成葉片早期脫落。以脅迫處理60 d數(shù)據(jù)作為篩選依據(jù)，在112個(gè)株系中選取各指標(biāo)前30%優(yōu)異株系，以母樹相關(guān)指標(biāo)作為參考，綜合株高、莖粗、新梢長度、凈光合速率和蒸騰速率指標(biāo)得到8個(gè)氮高效株系(表1)。

表1 文冠果氮高效利用株系形態(tài)和生理指標(biāo)篩選(60 d)Table 1 Changes in phenotype of NE lines under low-nitrogen treatment

續(xù)表1 文冠果氮高效利用株系形態(tài)和生理指標(biāo)篩選(60 d)Continue to table 1 Changes in phenotype of NE lines under low-nitrogen treatment

篩選出來的氮素高效利用的8個(gè)株系，在株高、莖粗和新梢長度顯著高于母樹(表1)，低氮脅迫處理情況下，植物可以通過體內(nèi)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)氮抵御環(huán)境變化，從而保證植株正常生長發(fā)育。另外，凈光合速率和蒸騰速率能夠反應(yīng)植株光合作用和新陳代謝的變化規(guī)律，植物受到逆境脅迫情況下，凈光合速率和蒸騰速率會(huì)顯著下降，下降的幅度可以作為植物抵御逆境脅迫的強(qiáng)弱標(biāo)準(zhǔn)。母樹低氮處理60 d后，凈光合速率和蒸騰速率下降50%，而篩選出來的氮高效利用株系下降20%左右，下降幅度顯著低于母樹低氮處理。綜合以上數(shù)據(jù)表明，在112個(gè)文冠果實(shí)生后代中篩選出來的8個(gè)株系符合低氮處理下能夠高效利用氮素，其中，編號(hào)DN-34，DN-83和DN-100株系高效利用氮素效果更好，作為接下來試驗(yàn)株系。

2.2 低氮處理對(duì)文冠果植株形態(tài)指標(biāo)的影響

在8個(gè)氮高效利用文冠果植株中選擇編號(hào)DN-34，DN-83和DN-100 3個(gè)株系進(jìn)行低氮(0.2 mmol/L N)處理，采用母樹作為對(duì)照。調(diào)查低氮處理過程中株系植株高度、新梢長度和莖粗動(dòng)態(tài)變化。隨著脅迫時(shí)間的延長，氮高效利用株系的植株高度(圖1)、莖粗(圖2)和新梢長度(圖3)顯著高于對(duì)照組(母樹)。處理初期差異不顯著，顯著差異主要出現(xiàn)在脅迫處理30 d后。綜合表型指標(biāo)數(shù)據(jù)，充分說明篩選出來的植株相比母樹來說，能夠抵抗低氮處理。

圖1 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株高度的影響Fig.1 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on plant height of Xanthoceras sorbifolia

圖2 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株莖粗的影響Fig.2 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on plant steam diameter of Xanthoceras sorbifolia

圖3 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株新梢長度的影響Fig.3 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on length of new stem of Xanthoceras sorbifolia

2.3 低氮處理對(duì)文冠果植株光合和蒸騰速率的影響

低氮處理?xiàng)l件下，氮高效利用株系凈光合速率逐漸上升后基本平穩(wěn)不變，受脅迫影響較少，而母樹隨脅迫處理時(shí)間延長，光合速率呈逐漸降低的趨勢(圖4)。

圖4 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株凈光合速率的影響Fig.4 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on net photosynthetic rate of Xanthoceras sorbifolia

隨著處理時(shí)間的延長，氮高效利用株系蒸騰速率整體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，而母樹蒸騰速率先上升后基本保持不變(圖5)。氮高效利用株系光合速率較高，蒸騰速率較低，凈積累量大，更利于植株本身的生長。氮高效利用株系蒸騰速率相比母樹來說比較低，降低蒸騰是植物對(duì)于外界環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制，造成脅迫處理蒸騰速率降低和光合速率升高的原因還有待于進(jìn)一步研究。

圖5 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株蒸騰速率的影響Fig.5 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on transpiration rate of Xanthoceras sorbifolia

2.4 低氮處理對(duì)文冠果植株防御系統(tǒng)的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是消除活性氧損傷過程中的第1道防線，是保護(hù)酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，SOD是衡量植物抵御脅迫能力的重要指標(biāo)。隨著處理時(shí)間的延長，氮素高效利用株系SOD含量升高，母樹基本保持不變(圖6)，這說明母樹沒有調(diào)配更高的SOD酶活的能力，不能清除脅迫產(chǎn)生的氧化物質(zhì)，而文冠果氮高效利用株系受到了脅迫后，SOD增高說明該株系能夠清除逆境脅迫下氧自由基的產(chǎn)生，維持植株正常生長發(fā)育。過氧化物酶(POD)和SOD變化趨勢基本一致，POD在處理60 d時(shí)，文冠果氮高效利用株系有微弱下調(diào)，這可能是隨著處理時(shí)間的延長，防御機(jī)制將要開始全面瓦解(圖7)。

圖6 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株SOD含量的影響Fig.6 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on SOD content in Xanthoceras sorbifolia

圖7 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株P(guān)OD含量的影響Fig.7 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on POD content in Xanthoceras sorbifolia

丙二醛(MDA)是反映植物體膜脂過氧化程度的指標(biāo)，丙二醛含量升高是活性氧持續(xù)累積的結(jié)果，導(dǎo)致細(xì)胞膜質(zhì)嚴(yán)重過氧化。低氮脅迫處理后，文冠果氮素高效利用株系MDA含量略有上升基本不變，對(duì)照組(母樹)隨著持續(xù)低氮處理， MDA含量不斷升高(圖8)。說明母樹在脅迫處理下細(xì)胞膜開始被氧化且不斷增加，而氮高效利用株系氧化程度基本不變，保持正常生命活動(dòng)。

圖8 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株MDA含量的影響Fig.8 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on MDA content in xanthoceras sorbifolia

在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)，植物體內(nèi)脯氨酸(Pro)的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸(Pro)含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性強(qiáng)的物種往往積累較多的脯氨酸。低氮脅迫下，氮高效利用植株顯著增加，而對(duì)照組(母樹)基本不變或變化不大(圖9)，文冠果氮高效利用株系積累更多的脯氨酸來抵御低氮逆境脅迫，說明脯氨酸和低氮脅迫具有一定的聯(lián)系。這可能是高濃度的脯氨酸可以參與氮代謝過程，從而為植株提供更多可以利用的氮。

圖9 低氮(0.2 mmol/L N)處理對(duì)文冠果植株P(guān)ro含量的影響Fig.9 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on Pro content in xanthoceras sorbifolia

3 討論

低氮處理后，對(duì)照組(母樹)表現(xiàn)出黃化的現(xiàn)象，而氮高效利用的文冠果植株黃化程度明顯降低。葉片黃化是由于葉綠素合成受阻，而植株葉綠素的含量與全氮養(yǎng)分含量密切相關(guān)，通常作為氮素養(yǎng)分脅迫的重要指標(biāo)。光合作用是植株生長過程中能量和物質(zhì)的基礎(chǔ)，還是各種生理和水肥條件的綜合反映[15]，而光合指標(biāo)中凈光合速率對(duì)植株的影響程度最大[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，隨葉片氮含量的增加，光合速率明顯增加[17]。該試驗(yàn)中，文冠果氮高效利用植株中葉片凈光合速率相比對(duì)照組更高。氮高效小麥品種的光合速率和光合碳同化能力更高，且發(fā)現(xiàn)較高的暗反應(yīng)速率是改善氮高效小麥品種物質(zhì)生產(chǎn)能力的重要內(nèi)在原因[18]。而在該研究中，氮高效利用植株在脅迫處理時(shí)，2個(gè)光合指標(biāo)均在增長，而對(duì)照組(母樹)在下降，表明氮高效利用植株在低氮脅迫下能保持較高的氮素積累，提高自身光合生產(chǎn)能力，保證氮高效品種在低氮條件下具有養(yǎng)分吸收所受影響不大的能力，這也為提高根系對(duì)養(yǎng)分的吸收利用從而達(dá)到減少肥料施用的效果提供重要的材料和理論基礎(chǔ)。

植物體內(nèi)保護(hù)酶是植物抵御外界逆境信號(hào)重要的保護(hù)機(jī)制，不同植株保護(hù)酶活性的差異常常是決定其抗逆性的關(guān)鍵。低氮處理對(duì)于植株來說是一種非生物脅迫，體內(nèi)的保護(hù)酶在一定程度上參與其中。該試驗(yàn)結(jié)果表明，低氮處理情況下，SOD和POD酶活顯著上升，與此同時(shí)丙二醛含量基本保持不變，這說明氮高效利用文冠果植株能夠提高自身的抗氧化機(jī)制，保護(hù)自身的細(xì)胞膜不被破壞，從此維持正常的生命活動(dòng)。植物體內(nèi)脯氨酸的合成有2條途徑：1) 以谷氨酸(Glu)為底物合成脯氨酸；2) 以鳥氨酸為底物合成脯氨酸。通常在植物受到脅迫或氮素缺乏的情況下，脯氨酸的主要來源就是谷氨酸合成途徑，在氮素供應(yīng)充足的情況下，植物中脯氨酸的主要合成途徑是以鳥氨酸為底物合成的。在生物體內(nèi)，脯氨酸不僅僅是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且還可作為膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑，從而對(duì)植物在滲透脅迫下的生長起到保護(hù)作用，對(duì)于鉀離子生物體內(nèi)另外一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在液泡中的積累情況，脯氨酸又可起到對(duì)細(xì)胞質(zhì)滲透平衡的調(diào)節(jié)作用。該試驗(yàn)說明，隨著低氮處理，氮素高效利用文冠果植株脯氨酸含量明顯高于對(duì)照組，脯氨酸的增加很可能是補(bǔ)充氮素的一種逆境表現(xiàn)，有待于進(jìn)一步挖掘機(jī)理。

4 結(jié)論

1) 該試驗(yàn)篩選出8個(gè)氮素高效利用文冠果株系，為選育耐低氮新品種提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源

2) 低氮處理?xiàng)l件下，氮素高效利用植株株高、莖粗和新梢長度顯著高于對(duì)照組(母樹)，凈光合速率大于對(duì)照組，植株長勢正常，維持正常生命活動(dòng)。

3) 氮高效利用文冠果植株相比對(duì)照組具有更好的保護(hù)酶系統(tǒng)，具體表現(xiàn)為SOD、POD和脯氨酸持續(xù)不斷上升，而MDA基本保持不變。