葛新　李林　王芳　郭廣成　李靖若　谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科　河南 鄭州　450052)

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芒柄花素抑制乳腺癌細(xì)胞HIF-1α/CXCR4信號以及細(xì)胞增殖和遷移

葛新李林王芳郭廣成李靖若谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科河南 鄭州450052)

目的研究芒柄花素對乳腺癌細(xì)胞行為的影響及其作用機制。方法利用不同濃度(5、10、15、20 μM)的芒柄花素處理MDA-MB-231細(xì)胞，分別處理48 h。應(yīng)用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和CXC趨化因子受體4(CXCR4)mRNA的表達(dá)，利用Western blot方法檢測細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)。構(gòu)建pShuttle-HIF-1α過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。利用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖，利用Transwell法檢測細(xì)胞體外遷移。結(jié)果相比于對照組，芒柄花素顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，并且具有劑量依賴性。過表達(dá)HIF-1α提高芒柄花素處理后細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的表達(dá)水平(P<0.05)，促進癌細(xì)胞增殖(P<0.05)，并促進癌細(xì)胞體外遷移(P<0.05)。結(jié)論芒柄花素可能通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α/CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響癌細(xì)胞增殖和遷移。

芒柄花素；乳腺癌；低氧誘導(dǎo)因子-1α；CXC趨化因子受體4；增殖；遷移

芒柄花素是黃芪的有效成分之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素能夠通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Akt磷酸化抑制細(xì)胞增殖[2]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在乳腺癌細(xì)胞生長、增殖、遷移、上皮間充質(zhì)化中具有重要作用[3-4]。目前，芒柄花素是否能夠通過調(diào)控HIF-1α和CXCR4影響乳腺癌細(xì)胞行為還不清楚。本研究通過探索芒柄花素在乳腺癌中的作用機制，從而為其在臨床治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料MDA-MB-231細(xì)胞購自于美國模式培養(yǎng)物保藏所；芒柄花素(C16H12O4，分子量268.264 08，純度≥98%)購自上海純優(yōu)生物；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜、硝酸纖維素膜購自大連寶生物公司；DNA Engine OpticonTM2熒光檢測系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；抗HIF-1α單抗、抗CXCR4單抗和酶標(biāo)羊抗鼠二抗購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理將MDA-MB-231細(xì)胞孵育于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機分為對照組、芒柄花素組、空載體組、HIF-1α過表達(dá)組。芒柄花素組分別用5、10、15、20 μM芒柄花素處理48 h?？蛰d體組和HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pShuttle空載質(zhì)粒和pShuttle-HIF-1α質(zhì)粒24 h后，利用20 μM芒柄花素處理48 h。

1.2.2構(gòu)建pShuttle-HIF-1α表達(dá)載體將人HIF-1α cDNA克隆至pGEMTEasy載體，測序鑒定質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pGEM-HIF-1α及表達(dá)空載體pShuttle用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和ApaⅠ雙酶切，將HIF-1α片段與表達(dá)載體pShuttle連接，然后將重組表達(dá)載體pShuttle-HIF-1α轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，應(yīng)用Western分析方法檢測HIF-1α的表達(dá)。

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔3×104個接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞達(dá)到80%融合時用于MTT實驗。MTT實驗檢測分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后進行。按實驗分組情況，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)后培養(yǎng)4 h。去掉上清，按照每孔150 μl加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。混勻后用酶標(biāo)儀(Bio-tek Instruments/USA)測定(測量波長為570 nm)。實驗重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.2.4Transwell法檢測細(xì)胞遷移用胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)3×105，轉(zhuǎn)移至Transwell 上層小室中，每孔鋪200 μl細(xì)胞，加入200 μl無血清培養(yǎng)基。下層板孔中加入600 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取4個低倍視野(100×)進行細(xì)胞計數(shù)，并計算平均值。

1.2.5qRT-PCR檢測利用Trizol試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞系總RNA，按照步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。查找Genbank序列設(shè)計并合成HIF-1α和CXCR4基因引物序列。HIF-1α上游引物：5’-CCT GAG CCT AAT AGT CCC-3’；下游引物：5’-GGT GGC ATT AGC AGT AGG-3’。CXCR4上游引物：5’-GGT GGT CTA TGT TGG CGT CT；下游引物： 5’-TGG AGT GTG ACA GCT TGG AG-3’。采用DNA Engine OpticonTM 2熒光檢測系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒進行基因表達(dá)的測定。取3次重復(fù)的平均值，靶基因的相對表達(dá)量的計算由目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin的拷貝數(shù)。

1.2.6Western blot檢測提取MDA-MB-231細(xì)胞中總蛋白，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用1%麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)移效果。將膜放在10 ml封閉液中(2%脫脂奶粉)1 h；加入抗HIF-1α單抗(1∶800)和抗CXCR4單抗(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育；加入酶標(biāo)羊抗鼠二抗抗體(1∶10 000)，室溫孵育2 h，利用化學(xué)發(fā)光法(ECL)，并在暗盒曝光。用凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析，比較蛋白條帶的相對積分吸光度(OD)值。

2　結(jié)果

2.1芒柄花素抑制HIF-1α mRNA和CXCR4 mRNA表達(dá)水平相比于對照組細(xì)胞，芒柄花素組MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)。 當(dāng)芒柄花素劑量≥10 μM時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且劑量為20 μM時效果最為明顯。見圖1。

圖1　芒柄花素處理后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4 mRNA的表達(dá)

2.2芒柄花素抑制HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白表達(dá)水平芒柄花素劑量≥10 μM時，MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；當(dāng)藥物劑量為20 μM時，效果最明顯。見圖2和圖3。

圖2　芒柄花素處理后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)

圖3　HIF-1α和CXCR4蛋白條帶定量分析

2.3過表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對CXCR4蛋白的影響與對照組比較，20 μM芒柄花素顯著抑制細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)(P<0.05)。與空載體+芒柄花素組比較，HIF-1α過表達(dá)+芒柄花素組中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4和圖5。

圖4　過表達(dá)HIF-1α后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)

圖5　HIF-1α和CXCR4蛋白條帶定量分析

2.4過表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對細(xì)胞增殖的影響相比于對照組細(xì)胞，芒柄花素處理后的細(xì)胞增殖速率顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖速率明顯上升(P<0.05)。見圖6。

圖6　MTT法檢測MDA-MB-231細(xì)胞增殖

2.5過表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對細(xì)胞遷移的影響芒柄花素處理后的細(xì)胞遷移數(shù)目相比于對照組顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α后，細(xì)胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05)。見圖7和圖8。

圖7　Transwell法檢測MDA-MB-231細(xì)胞遷移

圖8　MDA-MB-231細(xì)胞遷移數(shù)目分析

3　討論

HIF-1α/CXCR4信號異?；罨蛔C明與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其中包括乳腺癌[5-6]。芒柄花素的抑癌作用也在多個研究中得到報道[7]。Wu等[8]發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、微血管形成，并在體內(nèi)抑制乳腺癌進展相關(guān)的新血管形成。本研究利用不同劑量(5、10、15、20 μM)的芒柄花素體外處理乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，隨后檢測細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)芒柄花素能夠顯著抑制HIF-1α和CXCR4的表達(dá)，并且具有劑量依賴性，說明芒柄花素可能通過調(diào)控HIF-1α和CXCR4的表達(dá)影響乳腺癌疾病進展。

本研究構(gòu)建了pShuttle-HIF-1α過表達(dá)載體，并在體外轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α及其空載體對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HIF-1α可以顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)水平。隨后，本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制細(xì)胞增殖，而過表達(dá)HIF-1α則可以拮抗芒柄花素的作用，促進細(xì)胞增殖。同時，本研究也檢測了芒柄花素對癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示芒柄花素可抑制癌細(xì)胞的體外遷移，而過表達(dá)HIF-1α則可以促進細(xì)胞遷移，拮抗芒柄花素的作用。

綜上所述，芒柄花素能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的表達(dá)，過表達(dá)HIF-1α可抵消芒柄花素對CXCR4的表達(dá)調(diào)控以及對癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。因此，HIF-1α可能是芒柄花素的重要調(diào)控靶基因，進而影響癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

[1]Zhou R, Xu L, Ye M, et al. Formononetin inhibits migration and invasion of MDA-MB-231 and 4T1 breast cancer cells by suppressing MMP-2 and MMP-9 through PI3K/AKT signaling pathways[J]. Horm Metab Res, 2014, 46(11): 753-760.

[2]鄧櫻, 陳紅風(fēng). 黃芪注射液及其有效成分對乳腺癌細(xì)胞增殖和Akt磷酸化的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報, 2009, 7(12): 1174-1180.

[3]Wang W, He Y F, Sun Q K, et al. Hypoxia-inducible factor 1α in breast cancer prognosis[J]. Clin Chim Acta, 2014, 428: 32-37.

[4]Xu T P, Shen H, Liu L X, et al. The impact of chemokine receptor CXCR4 on breast cancer prognosis: a meta-analysis[J]. Cancer Epidemiol, 2013, 37(5): 725-731.

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[7]周瑞娟, 陳紅風(fēng), 葉媚娜, 等. 芒柄花素對不同亞型乳腺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J]. 腫瘤防治研究, 2012, 39(9): 1051-1055.

[8]Wu X Y, Xu H, Wu Z F, et al. Formononetin, a novel FGFR2 inhibitor, potently inhibits angiogenesis and tumor growth in preclinical models[J]. Oncotarget, 2015, 6(42): 44563-44578.

Formononetin regresses HIF-1α/CXCR4 signaling and cell proliferation and migration in breast cancer cells

Ge Xin, Li Lin, Wang Fang, Guo Guangcheng, Li Jingruo, Gu Yuanting

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the effect of formononetin on breast cancer cell behavior as well as its mechanism. MethodsMDA-MB-231 cells were exposed to different doses (5, 10, 15, 20 μM) of formononetin for 48 h respectively. The expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) mRNA and CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) mRNA were analyzed by qRT-PCR. The expression of HIF-1α and CXCR4 protein were analyzed by Western blot method. Furthermore, pShuttle-HIF-1α overexpression vector was constructed and transfected into MDA-MB-231 cells. Cell proliferation was determined by MTT assay. Cell migration was evaluated by Transwell assay. ResultsCompared with the control, exposure of formononetin significantly decreased both mRNA and protein expression of HIF-1α and CXCR4 (P<0.05) in a dose dependent way. Overexpression of HIF-1α raised HIF-1α and CXCR4 expression in cancer cells after formononetin treatment (P<0.05), promoting cell proliferation (P<0.05) and enhancing cell migration (P<0.05). ConclusionFormononetin might affect breast cancer cell proliferation and migration through modulation of HIF-1α/CXCR4 signaling transduction.

formononetin; breast cancer; hypoxia-inducible factor-1α; CXC chemokine receptor 4; proliferation; migration

谷元廷，E-mail：zzyuantinggu@126.com。

R 737.9doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2016.09.003

2016-03-04)