曹婧媛 袁陽(yáng) 程靜 盧宇 楊長(zhǎng)亮 陽(yáng)光 楊慧 周佳 吳雄英 袁慧軍 孫藝

耳聾是人類(lèi)最常見(jiàn)的感覺(jué)缺陷性疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的言語(yǔ)交流障礙，由遺傳因素和環(huán)境因素(如噪聲、創(chuàng)傷、藥物等) 共同作用所致[1]。常染色體顯性遺傳性聾新基因的傳統(tǒng)鑒定方式主要是利用大家系進(jìn)行連鎖分析和候選基因的全序列測(cè)序；由于需要家系中有較多的耳聾患者，以及檢測(cè)和分析方法效率較低，新基因的鑒定往往需要數(shù)年的研究。近十年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，遺傳性聾的致病基因研究飛速發(fā)展，越來(lái)越多的常染色體顯性遺傳性聾新基因利用高通量測(cè)序技術(shù)被鑒定，如：REST[2]、NLRP3[3]、COL11A[4]、PTPRQ[5]、DMXL2[6]等，該技術(shù)因其簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)勢(shì)成為遺傳性聾基因研究的最主流方法。本研究對(duì)一來(lái)自河南省的遺傳性聾家系進(jìn)行深入的臨床調(diào)查和基因研究，并運(yùn)用高通量測(cè)序和傳統(tǒng)的連鎖分析技術(shù)研究其致病基因，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1家系資料的采集及臨床聽(tīng)力學(xué)檢查 本研究收集到一個(gè)遺傳性聾家系(編號(hào)HBSY-012)，家系先證者就診于中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診，完成聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)及全身體格檢查，包括純音聽(tīng)閾檢測(cè)、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、聽(tīng)性腦干反應(yīng)及顳骨CT等，明確是否存在中耳、內(nèi)耳畸形、顱內(nèi)占位病變以及全身其它系統(tǒng)的異常。

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后，由耳鼻喉科的家系調(diào)查小組人員前往家系所在地進(jìn)行調(diào)查，所有參加本項(xiàng)目的家系成員均簽署知情同意書(shū)(未成年人由監(jiān)護(hù)人代簽)，然后進(jìn)行詳細(xì)的病史詢(xún)問(wèn)、填寫(xiě)問(wèn)診表，全身體格檢查，進(jìn)行純音聽(tīng)閾和聲導(dǎo)抗測(cè)試，并抽取10 ml外周血液樣本。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 耳聾表型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《關(guān)于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學(xué)及聽(tīng)力學(xué)描述術(shù)語(yǔ)建議案》[2]。

1.3家系樣本DNA的提取 該家系現(xiàn)存三代34人，共采集到28人血液樣本；對(duì)采集到的28例家系成員(18例正常聽(tīng)力者，10例耳聾者)的外周血進(jìn)行基因組DNA提取(Axygen公司AxyPrep血基因組DNA中量試劑盒)。

1.4高通量測(cè)序 采用Illumina公司的HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序(北京邁基諾公司)，首先對(duì)先證者進(jìn)行162個(gè)已知遺傳性聾相關(guān)基因靶向測(cè)序(基因信息見(jiàn)表1)，隨后完成全外顯子組測(cè)序 (Aligent Exome v5捕獲試劑盒)，平均深度超過(guò)200X。

1.4.1測(cè)序數(shù)據(jù)分析 全外顯子組測(cè)序后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，測(cè)序質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：Q20平均比例在90%以上、Q30平均比例在85%以上以及GC 含量分布無(wú)明顯偏移。測(cè)序數(shù)據(jù)分析獲得的3個(gè)樣本的變異根據(jù)樣本表型進(jìn)行共分離過(guò)濾，通過(guò)gnomAD(MAF>0.1%)過(guò)濾高頻變異位點(diǎn)，通過(guò)MGI數(shù)據(jù)庫(kù)、JacksonLab數(shù)據(jù)庫(kù)等耳聾模式動(dòng)物和功能研究數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與聽(tīng)覺(jué)功能相關(guān)的候選基因，通過(guò)PolyPhen2、SIFT等軟件預(yù)測(cè)候選變異的致病性。

1.4.2Sanger測(cè)序進(jìn)行家系驗(yàn)證 全外顯子組測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得到可疑致病位點(diǎn)，對(duì)家系中表型明確的家系成員的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，明確該可疑位點(diǎn)是否在家系中共分離。

1.5連鎖分析 對(duì)參與連鎖分析的20例家系成員的每名參與者提取20 ng基因組DNA，采用Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8全基因組芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)，通過(guò)優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)記分法的LOD(likelihood of odds)值評(píng)判連鎖的概率。

1.5.1數(shù)據(jù)分析 在進(jìn)行連鎖分析前，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控，包括去除等位基因頻率過(guò)低的、檢出率過(guò)低的、不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的位點(diǎn)，并將單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)作為標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，每0.3 cM挑選一個(gè)位點(diǎn)。

1.5.2家系連鎖分析 使用軟件merlin(v1.1.2)進(jìn)行連鎖分析，采用多點(diǎn)參數(shù)連鎖分析模型。通常，LOD值≥3認(rèn)為確定連鎖，LOD值≥2則可能連鎖，-2

表1 靶向測(cè)序的耳聾相關(guān)基因分類(lèi)、名稱(chēng)及定位

2 結(jié)果

2.1該家系的臨床表型特征 HBSY-012家系來(lái)自河南省某縣，現(xiàn)存三代共34人，14人診斷為感音神經(jīng)性聾，除3人(Ⅳ∶7、Ⅴ∶8及Ⅴ∶9)未接受檢測(cè)之外，其余11人均接受了詳細(xì)聽(tīng)力學(xué)檢查。該家系的14例患者均在5～7歲開(kāi)始出現(xiàn)聽(tīng)力下降，為語(yǔ)后聾，患者中年齡最大66歲，最小7歲；9例患者僅有耳聾癥狀，2例患者伴耳鳴，無(wú)眩暈等前庭功能障礙，無(wú)耳毒性藥物及環(huán)境噪聲接觸史，否認(rèn)外傷史，其他系統(tǒng)均無(wú)異常。家系中感音神經(jīng)性聾患者臨床資料見(jiàn)表2。

表2 家系中感音神經(jīng)聾患者性別、檢測(cè)及發(fā)病年齡、聽(tīng)力損失程度及伴耳鳴情況

2.2該家系遺傳學(xué)及耳聾表型特征

2.2.1家系遺傳學(xué)特征分析 HBSY-012家系圖(圖1)遺傳學(xué)特點(diǎn)：①四代連續(xù)發(fā)??；②每一代中男女均可患病；③男女患者均能將疾病傳給下一代；④每一例耳聾患者的雙親中均有一例耳聾患者；⑤家系發(fā)病率高，第二代至第四代耳聾患病率為100%；⑥第五代中Ⅴ∶11、Ⅴ∶13、Ⅴ∶14、Ⅴ∶15、Ⅴ∶16、Ⅴ∶17、Ⅴ∶18未達(dá)到發(fā)病年齡(5～7歲)，暫未出現(xiàn)聽(tīng)力下降情況，將其表型歸為不確定。該家系符合典型常染色顯性遺傳特點(diǎn)。

2.2.2HBSY-012家系的耳聾表型特征 以患者Ⅴ∶5為例，患兒7歲，6歲時(shí)出現(xiàn)聽(tīng)力下降，表現(xiàn)為以高頻下降為主的中度感音神經(jīng)性聾，雙耳對(duì)稱(chēng)，因其為家系患者中年齡最小者，代表該家系最初的發(fā)病特點(diǎn)。先證者Ⅴ∶7，年齡11歲，6歲時(shí)出現(xiàn)聽(tīng)力下降，現(xiàn)已發(fā)展為全頻受累的雙耳極重度感音神經(jīng)性聾。家系第Ⅲ、Ⅳ代成員中耳聾者均表現(xiàn)為全頻下降的重度或極重度感音神經(jīng)性聾。該家系的耳聾表型特點(diǎn)是遲發(fā)性語(yǔ)后聾，耳聾的進(jìn)展速度快，程度重。家系中耳聾患者純音聽(tīng)閾圖見(jiàn)圖2。

2.3連鎖分析結(jié)果 通過(guò)對(duì)20例家系成員(圖1中*表示參與連鎖分析的家系成員)的全基因組掃描SNP位點(diǎn)分型，使用軟件merlin(v1.1.2)進(jìn)行連鎖分析，得到11 152個(gè)有效tagSNPs數(shù)量，平均遺傳距離0.3 cM，LOD值>3的位點(diǎn)分布在9號(hào)染色體長(zhǎng)臂q31.1-q31.3上，遺傳標(biāo)記SNP-A-rs4273907至SNP-A-rs10981098之間,遺傳距離102.51～115.99 cM(物理位置102 977 295～114 591 623)，其中最大LOD值3.607 6，支持肯定連鎖(圖3)。而其它染色體上均未發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的連鎖關(guān)系。

圖1 HBSY-012家系圖 √:表示有DNA樣本的家系成員;*:表示參與連鎖分析的家系成員

圖2 HBSY-012家系11例患者純音聽(tīng)閾圖 ○ 右耳氣導(dǎo)聽(tīng)閾,× 左耳氣導(dǎo)聽(tīng)閾

2.4高通量測(cè)序結(jié)果 首先，選取先證者Ⅴ∶7進(jìn)行162個(gè)已知耳聾基因篩查，未發(fā)現(xiàn)致病突變。然后，選取家系中Ⅳ∶9、Ⅴ∶3、Ⅴ∶4進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，其中Ⅳ∶9及Ⅴ∶4為家系中的耳聾患者，Ⅴ∶3為家系中的正常人。篩選Ⅳ∶9及Ⅴ∶4共有的雜合變異，過(guò)濾Ⅴ∶3攜帶的變異，共獲得2 924個(gè)候選變異，通過(guò)gnomAD過(guò)濾高頻變異后，在連鎖分析定位的第9號(hào)染色體q31.1-q31.3區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)候選變異，在該區(qū)間以外的候選變異中，通過(guò)MGI數(shù)據(jù)庫(kù)、JacksonLab數(shù)據(jù)庫(kù)等耳聾模式動(dòng)物和功能研究數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出可能與聽(tīng)覺(jué)功能相關(guān)的4個(gè)候選基因，候選變異為ANKMY2基因NM_020319：c.822_826del、DDX49基因NM_019070:c.341C>T、DEFB129基因NM_080831:c.284G>T以及EVI5基因NM_005665：c.2399C>T，共4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)(圖4)。

圖3連鎖分析結(jié)果圖橫坐標(biāo)表示每個(gè)SNP在9號(hào)染色體上所對(duì)應(yīng)的遺傳距離,縱坐標(biāo)表示每個(gè)SNP計(jì)算的LOD 值,箭頭表示HBSY-012家系在9 號(hào)染色體遺傳距離102.51～115.99 cM之間獲得最大LOD值3.607 6

圖4 Sanger測(cè)序圖a.ANKMY2基因c.822_826del變異; b. DDX49基因c.341C>T變異; c.DEFB129基因c.284G>T變異; d.EVI5基因c.2399C>T變異

將上述4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)分別進(jìn)行家系驗(yàn)證，結(jié)果4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)在家系中均無(wú)共分離現(xiàn)象，提示都不是家系的致病突變。

3 討論

3.1HBSY-012家系臨床表型特征分析 HBSY-012家系的發(fā)病年齡5～7歲，早期以高頻下降為主，聽(tīng)力損失的特點(diǎn)是進(jìn)展速度快，程度重。家系中年齡最小的患者Ⅴ∶5， 年齡7歲，6歲時(shí)出現(xiàn)聽(tīng)力下降，表現(xiàn)為以高頻下降為主的中度感音神經(jīng)性耳聾；先證者Ⅴ∶7，年僅11歲，6歲時(shí)出現(xiàn)聽(tīng)力下降，現(xiàn)已達(dá)極重度聽(tīng)力損失，且第Ⅲ、Ⅳ代患者均為全頻下降的重度或極重度感音神經(jīng)性聾。家系中參與研究的11例耳聾患者除了兩例伴有耳鳴癥狀，其他患者耳聾為唯一癥狀，全身其他系統(tǒng)均正常，無(wú)耳毒性藥物及環(huán)境噪聲接觸史。通過(guò)遺傳圖譜可發(fā)現(xiàn)，該家系共5代，現(xiàn)存3代共計(jì)34人，耳聾患者14人，第Ⅱ代至第Ⅳ代直系血緣關(guān)系親屬耳聾患病率為100%，男女均有患病，符合典型的常染色體顯性遺傳性非綜合征型聾。

3.2致病基因的鑒定 耳聾基因鑒定的主要方式有家系連鎖分析法和高通量測(cè)序法。家系連鎖分析法在高通量測(cè)序出現(xiàn)之前曾被作為最主流的方法，已被證實(shí)是尋找家系耳聾致病基因最準(zhǔn)確的方法之一，適用于表型明確的耳聾大家系，是從表型到基因型的正向研究。通過(guò)家系成員連鎖分析，可將致病基因確定在染色體上的某個(gè)區(qū)間內(nèi)，再逐步對(duì)區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行排查；但連鎖區(qū)域內(nèi)可能多達(dá)上百個(gè)基因需要逐個(gè)進(jìn)行突變檢測(cè)，工作量龐大為其缺點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展有效地解決了上述技術(shù)難點(diǎn)，2011年，Zheng等[8]將其課題組于1995年連鎖分析定位的DFNA4(19q12-13.4)家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，確定了該家系的致病基因CEACAM16。

目前遺傳性聾基因研究應(yīng)用的高通量測(cè)序主要包括耳聾相關(guān)基因靶向測(cè)序、全外顯子組測(cè)序及全基因組測(cè)序。耳聾相關(guān)基因靶向測(cè)序是將目前已知的耳聾相關(guān)基因集中在一個(gè)panel中進(jìn)行檢測(cè)，成本低，耗時(shí)短，生物信息學(xué)分析較簡(jiǎn)便。全外顯子組測(cè)序采用序列捕獲技術(shù)將基因組DNA全部外顯子區(qū)域一次性捕獲下來(lái)，然后進(jìn)行集中測(cè)序。外顯子區(qū)為蛋白編碼區(qū)，雖然只占到人類(lèi)基因組的1%，但其中包含基因組DNA上所有蛋白質(zhì)的編碼序列[9]。研究表明，遺傳性聾絕大多數(shù)為單基因病，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，大部分孟德?tīng)栠z傳病的致病突變均位于外顯子區(qū)域[10]。目前認(rèn)為全外顯子組測(cè)序?yàn)殍b定遺傳性聾致病基因最有效的方法，近年來(lái)就有多個(gè)直接利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)鑒定的耳聾新基因，如：LMX1A[11]、IFNLR1[12]、MYO3A[13]、PDE1C[14]、ESRP1[15]等。全基因組測(cè)序?qū)⑼怙@子區(qū)域及內(nèi)含子區(qū)域同時(shí)捕獲，可以對(duì)外顯子組區(qū)域以外的區(qū)域進(jìn)行有效的基因檢測(cè)，對(duì)于部分不能通過(guò)全外顯子組測(cè)序鑒定出致病基因的家系或散發(fā)病例還需要全基因組測(cè)序進(jìn)行更全面的基因檢測(cè)。

本研究首先選取先證者Ⅴ∶7進(jìn)行162個(gè)已知遺傳性聾相關(guān)基因靶向測(cè)序，結(jié)果未檢測(cè)出致病突變。分析可能的原因?yàn)橹虏』蛭窗ㄔ谒鶛z測(cè)的基因中或?yàn)樯形窗l(fā)現(xiàn)的耳聾基因，抑或突變位點(diǎn)位于非編碼區(qū)域。然后，本研究采取高通量測(cè)序和連鎖分析相結(jié)合的方法探索HBSY-012家系的耳聾致病基因，對(duì)20名家系成員進(jìn)行全基因組掃描SNP位點(diǎn)分型，結(jié)果進(jìn)行連鎖分析，LOD值>3的位點(diǎn)分布在9號(hào)染色體q31.1-q31.3上，遺傳標(biāo)記SNP-A-rs4273907至SNP-A-rs10981098之間,遺傳距離為102.51～115.99 cM (物理位置為102 977 295～114 591 623)，其中最大LOD值3.607 6；將該家系的致病基因定位于第9號(hào)染色體q31.1-q31.3區(qū)間，與已知耳聾基因座位DFNA56(9q31.3-q34.3)毗鄰；2013年Zhao等[16]已將DFNA56家系應(yīng)用全外顯子組測(cè)序，明確了家系致病基因TNC。

本研究選取家系中Ⅳ∶9、Ⅴ∶3、Ⅴ∶4進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，Ⅳ∶9及Ⅴ∶4為家系中的耳聾患者，Ⅴ∶3作為家系中的正常人，共獲得2 924個(gè)候選變異，通過(guò)gnomAD過(guò)濾高頻變異后，在連鎖分析定位的第9號(hào)染色體q31.1-q31.3區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)致病突變；在該區(qū)間以外的候選變異中，通過(guò)MGI數(shù)據(jù)庫(kù)、JacksonLab數(shù)據(jù)庫(kù)等耳聾模式動(dòng)物和功能研究數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出可能與聽(tīng)覺(jué)功能相關(guān)的4個(gè)候選基因，候選變異為ANKMY2基因NM_020319：c.822_826del、DDX49基因NM_019070:c.341C>T、DEFB129基因NM_080831:c.284G>T以及EVI5基因NM_005665：c.2399C>T共4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)；將上述4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)分別進(jìn)行家系驗(yàn)證，結(jié)果該4個(gè)候選基因變異位點(diǎn)在家系中均無(wú)共分離現(xiàn)象，提示都不是家系的致病突變。

因此，考慮該家系的致病突變可能來(lái)源于基因的非編碼區(qū)域或者罕見(jiàn)的CNV/SV，擬進(jìn)一步擴(kuò)大尋找范圍進(jìn)行全基因組測(cè)序，以鑒定致病基因突變。