曹力元，牟 為

上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025

程序性壞死（necroptosis）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，細(xì)胞死亡分為凋亡和壞死。其中細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指有核細(xì)胞在一定條件下通過(guò)啟動(dòng)自身內(nèi)部信號(hào)通路，主要通過(guò)內(nèi)源性DNA 內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過(guò)程，是一種主動(dòng)有序的細(xì)胞死亡方式。而壞死（necrosis）是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素的作用而產(chǎn)生的一種無(wú)序死亡過(guò)程，其發(fā)生是不可控的，且往往具有不可逆性。隨著相關(guān)研究的逐漸深入，研究人員發(fā)現(xiàn)了另外一種細(xì)胞死亡方式，具有與壞死類似的形態(tài)學(xué)特征，但卻受細(xì)胞內(nèi)特定的信號(hào)通路調(diào)控，并且在凋亡被抑制的條件下，作為一種替代方式來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞死亡。2005 年，Degterev 等[1]首次提出了程序性壞死的概念，即指細(xì)胞的一種程序性死亡（programmed cell death）方式（程序性死亡還包括凋亡和焦亡）。他們發(fā)現(xiàn)，一種小分子化合物necrostatin-1（Nec-1）可以抑制程序性壞死的發(fā)生，進(jìn)一步證明了程序性壞死的可調(diào)控性。在程序性壞死的信號(hào)通路中，最核心、最經(jīng)典的通路由3 個(gè)重要部分組成：受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混交激酶域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。由此得出一個(gè)與傳統(tǒng)理論不同的觀點(diǎn)，即壞死也可以是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，其發(fā)生和發(fā)展是可調(diào)控的。本文重點(diǎn)討論程序性壞死在疾病中的作用，包括在腫瘤和炎癥性疾病中的雙重作用，并探討程序性壞死的誘導(dǎo)劑和抑制劑，以及誘導(dǎo)或抑制程序性壞死所具有的科研和臨床意義。

1 程序性壞死在疾病中的影響及調(diào)控

程序性壞死與多種疾病相關(guān)。以往的研究認(rèn)為，程序性壞死參與了炎癥性疾病和缺血再灌注等疾病的發(fā)展過(guò)程；近年來(lái)的研究[2-3]表明，程序性壞死與惡性腫瘤也密切相關(guān)，其有望成為抗癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

1.1 腫瘤

以往很多程序性壞死相關(guān)疾病的研究是聚焦于炎癥性疾病，然而近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注程序性壞死在腫瘤中的作用。研究[2]表明，程序性壞死相關(guān)分子RIPK1、RIPK3 和MLKL 與放射治療（放療）后的腫瘤再增殖密切相關(guān)。此外，乳腺癌和肺癌等腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移。使用程序性壞死抑制劑Nec-1 或條件性敲除內(nèi)皮細(xì)胞Ripk3 基因能夠減少腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞壞死，抑制腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移[4]。雖然內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死可能利于腫瘤轉(zhuǎn)移，但是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死卻有望成為治療腫瘤的新策略。許多研究[5-6]表明，程序性壞死通路中的關(guān)鍵蛋白在某些腫瘤中是低表達(dá)的，比如RIPK3在原發(fā)性結(jié)腸癌中低表達(dá)[6]。由此可以推斷，在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中程序性壞死被抑制，這有可能是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的原因之一。目前，抗癌藥的機(jī)制主要是靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但存在腫瘤細(xì)胞耐藥問(wèn)題。Han等[3]人發(fā)現(xiàn)，在耐藥腫瘤細(xì)胞中可以通過(guò)激活程序性壞死通路來(lái)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。事實(shí)上，程序性壞死被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡受到抑制或阻斷時(shí)發(fā)生的一種替代性死亡方式[7]。雖然前面提到程序性壞死會(huì)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但也有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)天然化合物紫草素和酯蟾毒配基能通過(guò)激活程序性壞死從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，程序性壞死有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

1.2 炎癥性疾病

發(fā)生了程序性壞死后，細(xì)胞破裂，細(xì)胞的炎性物質(zhì)（如炎癥因子等）釋放進(jìn)入組織液中，引起炎癥反應(yīng)；同時(shí)炎癥反應(yīng)又能引起包括程序性壞死的細(xì)胞壞死。與程序性壞死相關(guān)的炎癥性疾病包括腸炎、腎炎和骨關(guān)節(jié)炎等。以腸炎[10]為例，建立小腸上皮細(xì)胞Fas 相關(guān)死亡域蛋白（Fas-associated protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD）基因敲除的小鼠模型后，小鼠馬上發(fā)生了小腸炎和大腸炎。然而敲除Ripk3 基因則能阻止腸炎的發(fā)生，表明程序性壞死參與了腸炎的發(fā)生過(guò)程。RIPK1 和RIPK3 能激活炎癥信號(hào)通路，分泌促炎因子。如RIPK3 能夠激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligometric domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體，引起白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1）等細(xì)胞因子的釋放。進(jìn)一步研究[11]表明，RIPK3 在Mlkl 敲除的情況下仍能激活NLRP3，表明在細(xì)胞死亡前炎癥反應(yīng)就已經(jīng)發(fā)生。事實(shí)上，程序性壞死還參與其他疾病，如缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病等的炎癥反應(yīng)，加重細(xì)胞或組織損傷。

綜上所述，程序性壞死在疾病中的作用可分為2 個(gè)方面：既能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)和加重炎癥性疾病，是一個(gè)危險(xiǎn)因素；又能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，提供了一個(gè)潛在的治療策略。

2 程序性壞死的誘導(dǎo)機(jī)制及誘導(dǎo)劑

2.1 誘導(dǎo)機(jī)制

程序性壞死可由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、DNA 損傷、輻射等引起，其中以TNF 誘導(dǎo)發(fā)生的程序性壞死最為經(jīng)典。本文重點(diǎn)討論TNF-α 誘發(fā)程序性壞死的信號(hào)通路。TNF-α 為TNF 的一種分型，是重要的促炎細(xì)胞因子，參與介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)。TNF-α 激活腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）可引起多種信號(hào)通路，包括核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、RIPK1 非依賴性凋亡（RIPK1 independent apoptosis，RIA）、RIPK1 依賴性凋亡（RIPK1 dependent apoptosis，RDA）和程序性壞死。三聚型TNF-α 激活TNFR1，通過(guò)結(jié)合外側(cè)死亡結(jié)構(gòu)域的方式招募RIPK1 和腫瘤壞死因子受體1 相關(guān)死亡域蛋白（TNFR1-associated death domain protein，TRADD）；TRADD 招 募 腫 瘤 壞 死因子受體相關(guān)因子2/5（TNF receptor-associated factor 2/5，TRAF2/5）和E3 泛素連接酶cIAP 1/2，形成復(fù)合物complex Ⅰ。如果complex Ⅰ中的TRADD 招募FADD 和半胱天冬酶caspase-8，在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物complex Ⅱ a，則介導(dǎo)RIA。如果RIPK1 形成RIPK1 二聚體，與FADD和caspase-8 形成復(fù)合物complex Ⅱ b，則介導(dǎo)RDA。而當(dāng)caspase-8 活性被抑制時(shí)，RIPK1 二聚體與RIPK3 結(jié)合形成復(fù)合物complex Ⅱ c（即RIPK1-RIPK3 復(fù)合物，又稱為necrosome），complex Ⅱ c 進(jìn)一步募集并磷酸化MLKL，MLKL 作為細(xì)胞死亡的執(zhí)行者最終會(huì)導(dǎo)致程序性壞死的發(fā)生[7]（圖1）。

圖1 程序性壞死的調(diào)控通路及其與不同疾病的關(guān)系Fig 1 Signaling pathways of necroptosis and its role in different diseases

雖然TNF 不僅誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，還啟動(dòng)程序性壞死，具有強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，但當(dāng)大量的TNF 進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生類似膿毒血癥的癥狀，甚至引起中毒性休克，最終導(dǎo)致多器官衰竭和死亡。TNF 嚴(yán)重的不良反應(yīng)使得其在臨床上的應(yīng)用受到了極大的限制，目前僅應(yīng)用于少數(shù)疾病的局部治療，如TNF 與γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和米爾法蘭（melphalan）聯(lián)合治療四肢黑色素瘤和軟組織肉瘤[12]，采用孤立肢體灌注方法避免TNF 的系統(tǒng)性反應(yīng)?？紤]到TNF 應(yīng)用的局限性，尋找一些可替代的程序性壞死誘導(dǎo)劑成為了新的研究方向之一。

2.2 誘導(dǎo)劑紫草素

事實(shí)上，通過(guò)程序性壞死途徑來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞的思路已經(jīng)在一種天然化合物——紫草素（shikonin）的相關(guān)研究中得到了證實(shí)。紫草素是從天然植物中提取出來(lái)的一種萘醌，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，發(fā)揮抗腫瘤的作用，如膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，紫草素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并引起RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表達(dá)水平升高，此過(guò)程能被Nec-1 抑制而不能被caspase 抑制劑Z-VAD-fmk 抑制，說(shuō)明紫草素在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是通過(guò)程序性壞死通路引起細(xì)胞死亡而不是凋亡通路[13]。紫草素引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死可能與胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量累積有關(guān)。程序性壞死的過(guò)程往往伴隨著ROS 水平升高，ROS 累積能夠引起雙鏈DNA 斷裂。使用線粒體超氧物清除劑抑制ROS 的生成能阻止紫草素誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，而使用ROS 促進(jìn)劑能顯著提高細(xì)胞死亡率[14]。雖然研究[14]表明ROS 位于RIPK1 和RIPK3 的下游通路，但是清除ROS 會(huì)抑制RIPK1 和RIPK3 的結(jié)合，而增加ROS能夠促進(jìn)兩者的結(jié)合，說(shuō)明ROS 的生成反過(guò)來(lái)又能促進(jìn)RIPK1-RIPK3 復(fù)合物的形成。除了有望應(yīng)用于膠質(zhì)瘤和骨髓瘤這樣尚無(wú)有效治療方法的疾病，紫草素還可以通過(guò)誘導(dǎo)程序性壞死來(lái)應(yīng)對(duì)腫瘤耐藥問(wèn)題。Han 等[3]發(fā)現(xiàn)，紫草素能在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 中誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，這種非凋亡途徑的細(xì)胞死亡方式啟發(fā)研究人員進(jìn)一步探索紫草素在耐藥腫瘤細(xì)胞系中的作用。在Han 等[3]的研究中，他們采用過(guò)表達(dá)P 糖蛋白、Bcl-2 和Bcl-xL 的方式構(gòu)建了2 種不同機(jī)制的耐藥細(xì)胞系模型。實(shí)驗(yàn)證明，紫草素能夠誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)P 糖蛋白的耐藥細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。雖然與非耐藥細(xì)胞相比，紫草素在耐藥細(xì)胞中的殺傷作用需要一定的反應(yīng)時(shí)間，但從最終結(jié)局來(lái)看，過(guò)表達(dá)P 糖蛋白不會(huì)影響紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。在過(guò)表達(dá)Bcl-2 和Bcl-xL 的抗凋亡MCF-7 腫瘤細(xì)胞系中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)[3]也證實(shí)紫草素可以誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。這些實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的研究思路有望進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤的耐藥研究。

2.3 誘導(dǎo)劑苦參堿及其他化合物

苦參堿（matrine）是從中草藥苦參中提取出來(lái)的一種生物堿，在許多研究中被證實(shí)具有抗癌效果，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Xu 等[15]發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠在膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死，腫瘤細(xì)胞具有典型的壞死樣特征，并且Nec-1 能夠抑制細(xì)胞死亡。同時(shí)，苦參堿能夠引起RIPK3表達(dá)水平升高，進(jìn)而活化其下游的MLKL，促進(jìn)ROS的生成。因此，在苦參堿誘導(dǎo)的CCA 細(xì)胞程序性死亡中，既涉及RIPK1-RIPK3-MLKL 信號(hào)通路，又有RIPK3-MLKL-ROS 通路的參與。事實(shí)上，苦參堿在很多腫瘤研究中被認(rèn)為是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用，但在CCA中卻是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死而發(fā)揮作用。這表明不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡和壞死的敏感度不一樣，某些腫瘤（如CCA）具有壞死敏感性。因此，在某些壞死通路易激活的腫瘤細(xì)胞中，可以通過(guò)特異性地誘導(dǎo)程序性壞死來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，從而在一定程度上解決腫瘤的耐藥問(wèn)題。

此外，還有很多其他化合物也可以激活程序性壞死通路（表1）。

表1 程序性壞死的誘導(dǎo)劑Tab 1 Inducers of necroptosis

3 程序性壞死的抑制劑

3.1 特異性抑制劑Nec-1

針對(duì)不同的作用靶點(diǎn)，程序性壞死的抑制劑可分為RIPK1 抑制劑、RIPK3 抑制劑和MLKL 抑制劑（表2）。在程序性壞死的抑制劑中，Necrostatins 家族的相關(guān)研究最多，其中以Nec-1 最為典型。Nec-1 是一種小分子生物堿，通過(guò)作用于RIPK1 的T 環(huán)結(jié)構(gòu)，抑制RIPK1 的活性，從而抑制RIPK1-RIPK3 復(fù)合體的形成，阻斷下游程序性壞死的發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Nec-1 后，通常表現(xiàn)為RIPK1、RIPK3 和MLKL 的mRNA 水平和蛋白表達(dá)水平下降，以及細(xì)胞死亡率下降。

表2 程序性壞死的抑制劑Tab 2 Inhibitors of necroptosis

由于程序性壞死與凋亡的部分上游通路相同，RIPK1的激活在程序性死亡和RDA 信號(hào)通路中至關(guān)重要，研究[29]表明Nec-1 不僅能阻止程序性壞死，也能抑制細(xì)胞凋亡。然而Jie 等[30]卻得出了相反的研究結(jié)果：在炎癥模型中，Nec-1 可以特異性地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。此外，還有一些學(xué)者[31]認(rèn)為Nec-1 不影響凋亡的發(fā)生。如此不同的研究結(jié)果提示，程序性壞死與凋亡之間可能通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)連接，因此在不同的疾病和條件下應(yīng)用Nec-1 會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在TNF-α 引起的經(jīng)典信號(hào)通路中，凋亡分為2 種：RIA 和RDA。當(dāng)?shù)蛲鲆訰IA 為主時(shí)，由于此時(shí)凋亡的發(fā)生不依賴RIPK1，故Nec-1 不影響凋亡的發(fā)生；而當(dāng)?shù)蛲龅姆绞绞荝DA 時(shí)，Nec-1 抑制RIPK1 的活性，導(dǎo)致complex Ⅱ a 無(wú)法形成，故凋亡通路受阻。而導(dǎo)致Jie 等[30]的研究結(jié)果的原因可能是凋亡與程序性壞死在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)換，當(dāng)?shù)蛲霰灰种茣r(shí)，細(xì)胞通過(guò)程序性壞死途徑死亡，而當(dāng)程序性壞死被Nec-1 抑制時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)而通過(guò)凋亡途徑死亡[16]。由此可以看出，Nec-1 在不同條件下可以產(chǎn)生不同的效應(yīng)，具有細(xì)胞特異性和疾病特 異性。

3.2 Nec-1 的保護(hù)作用

由于程序性壞死在許多非腫瘤性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著“推波助瀾”的作用，Nec-1 作為其特異性抑制劑能夠在許多疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。在心血管系統(tǒng)疾病中，Nec-1 能顯著縮小小鼠心肌梗死模型的梗死面積，起到心肌保護(hù)作用[32]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，以腦出血為例，Nec-1 可以改善小鼠腦水腫、減少顱內(nèi)損傷以及提高腦神經(jīng)功能[33-34]。Nec-1 還可以在急性肝衰竭、急性腎衰竭和缺血再灌注等疾病模型中發(fā)揮保護(hù)作用，緩解疾病進(jìn)展，提高小鼠的生存期和疾病預(yù)后。

除了程序性壞死和凋亡，Nec-1 也可以通過(guò)作用于ROS 通路發(fā)揮其保護(hù)作用。由于ROS 通路位于RIPK1 下游，應(yīng)用Nec-1 可以降低疾病狀況下急劇升高的ROS 水平。在小鼠心肌收縮功能障礙模型中，應(yīng)用Nec-1 能顯著抑制ROS 的生成[35]；在缺氧引起的細(xì)胞損傷中，Nec-1能夠提高細(xì)胞活性，抑制ROS 生成及其對(duì)細(xì)胞的損傷[36]；在急性肝衰竭小鼠模型中，Nec-1 不僅能夠緩解線粒體功能障礙，抑制肝細(xì)胞胞內(nèi)ROS 的生成，還能緩解胞外ROS 引起的肝細(xì)胞損傷[37]。雖然Nec-1 降低ROS 水平的具體機(jī)制還不是很清楚，但可以確定的是RIPK1 的激活在ROS 相關(guān)通路中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此應(yīng)用Nec-1不僅能阻斷RIPK1-RIPK3-MLKL 通路，還能抑制RIPK1下游的ROS 通路，從而在多種疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，程序性壞死及其在疾病中的作用近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注，逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文綜述了目前程序性壞死在多種疾病中的不同作用，并且提出了對(duì)應(yīng)的治療策略。在腫瘤疾病中，程序性壞死能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，因此在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死可能成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)；而在其他疾病（如炎癥性疾?。┲?，程序性壞死能引起細(xì)胞死亡和組織損傷，因而抑制程序性壞死可以緩解疾病。所以，進(jìn)一步研究程序性壞死的機(jī)制，尋找或研發(fā)特異性誘導(dǎo)劑和抑制劑，使之應(yīng)用于臨床研究，有望成為疾病治療的新策略。

參·考·文·獻(xiàn)

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