賀 明，魏 倩，張穎婷

上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海200025

與其他典型的調(diào)節(jié)性細胞死亡方式（如細胞凋亡、細胞壞死等）不同，鐵死亡（ferroptosis）是近年來被提出的一種與細胞代謝密切相關(guān)的鐵依賴性的新型細胞程序性死亡方式。一直以來，肝臟鐵超載被認為是多種肝臟疾病加重的主要誘因之一[1]。最新的研究結(jié)果[1]表明，鐵死亡可在酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、肝纖維化及肝癌等多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，但其確切的機制仍不清楚。本文整理了鐵死亡在不同肝臟疾病中的作用機制，以期為肝臟疾病的預防和治療提供新 思路。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的概念和特征

鐵死亡由Brent R. Stockwell 博士于2012 年命名，是一種鐵依賴性的由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積而導致的細胞調(diào)節(jié)性死亡方式[2]。鐵死亡在形態(tài)學、生化特征和調(diào)控機制上與其他細胞死亡方式（如凋亡、壞死等）有所不同（表1）[3]：① 形態(tài)學方面。細胞凋亡時表現(xiàn)為細胞膜無破裂，胞內(nèi)出現(xiàn)典型的凋亡小體。細胞壞死時表現(xiàn)為細胞腫脹，細胞核濃縮、碎裂、溶解，染色質(zhì)染色變淡、呈絮狀，細胞器膨大或碎裂。鐵死亡則無典型的細胞凋亡和壞死表現(xiàn)，主要為細胞膜破裂和出泡，線粒體萎縮，膜密度增加、嵴減少，細胞核缺乏染色質(zhì)凝集等。②生化特征和調(diào)控機制方面。細胞凋亡過程主要依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），凋亡發(fā)生時胞漿Ca2+和pH 水平升高，核酸內(nèi)切酶被激活導致核DNA 片段化，細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，線粒體膜電位降低，通透性增強。細胞壞死會引起局部嚴重的炎癥反應，與受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）等多種信號通路有關(guān)。而鐵死亡時，細胞內(nèi)Fe2+發(fā)生聚集，脂質(zhì)過氧化水平顯著升高、ROS 增加，細胞半胱氨酸攝取減少、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭并釋放花生四烯酸等介導因子等[4]；鐵死亡的實質(zhì)是Fe2+累積和細胞氧化還原代謝發(fā)生紊亂，即細胞抗氧化能力下降，ROS 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在細胞內(nèi)得不到還原而大量累積，進而誘導細胞死亡；其與細胞凋亡和壞死發(fā)生機制間均不存在交叉，抑制細胞凋亡、壞死的小分子對鐵死亡無抑制作用[5]。

表1 3 種細胞死亡方式的比較Tab 1 Comparison of three types of cell death

1.2 鐵死亡的發(fā)生機制

越來越多的研究證明，鐵代謝紊亂和ROS 累積是不同病理生理情況下鐵死亡的重要啟動因素。其二者具體的觸發(fā)機制，總結(jié)如下。

1.2.1 鐵代謝紊亂 細胞代謝過程中積累的ROS 主要為超氧自由基陰離子（O2.-）和過氧化氫（H2O2）。在游離Fe2+的作用下其會轉(zhuǎn)化為羥基自由基（HO-），進一步對大分子特別是脂質(zhì)分子如多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）、聚不飽和脂肪酸等進行氧化，生成脂質(zhì)過氧化物。這些涉及鐵并生成羥基或烷氧基自由基（RO-）的反應被稱為芬頓反應（Fenton 反應）[6]。細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物一旦被大量累積且不能被及時清除，就會對DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜造成氧化損傷，最終導致細胞鐵死亡。

同時有研究[2]顯示，外源性Fe2+的攝入可以加劇由鐵死亡誘導劑erastin 誘發(fā)的鐵死亡，而其他二價金屬離子并不能加劇該效果。Dixon 等[2]發(fā)現(xiàn)鐵反應元件結(jié)合蛋白2 [iron responsive element binding protein 2，IREB2；又名 鐵 調(diào) 節(jié) 蛋 白2（iron regulatory protein 2，IRP2） ]，主要 通 過IRE-IRP（iron responsive element-iron regulatory protein）系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控鐵代謝相關(guān)基因，是介導erastin導致人纖維肉瘤細胞HT-1080 和Calu-1 發(fā)生鐵死亡的重要蛋白。此外，Yang 等[7]發(fā)現(xiàn)磷酸化酶激酶催化亞基γ2（phosphorylase kinase catalytic subunit γ2，PHKG2）可 通過調(diào)節(jié)游離Fe2+的含量正向調(diào)節(jié)鐵死亡，而抑制PHKG2表達則可起到鐵螯合的作用。但有關(guān)PHKG2 調(diào)控鐵代謝的作用機制尚不清楚，需做進一步研究。

1.2.2 ROS 累積 正常情況下，脂氧合酶（lipoxygenases，LOXs）可通過催化膜脂PUFAs 的雙加氧反應生成脂肪酸過氧化物[7]，然后在谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase，GPX4）的介導下轉(zhuǎn)化為脂肪酸醇。但當GPX4 失活時上述過程被阻斷，細胞內(nèi)大量的ROS 則可與膜脂PUFAs 發(fā)生Fenton 反應，導致細胞膜損傷從而觸發(fā)鐵死亡。因此，脂質(zhì)ROS 的大量累積是驅(qū)動鐵死亡的重要因素之一。而有研究[8]發(fā)現(xiàn)，抑制5-LOX 可抑制鐵死亡的發(fā)生，還可減輕由谷氨酸誘導的神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷。另有研究[9]發(fā)現(xiàn)，細胞可通過胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體（the cystine/glutamate antiporter system，system）從胞外攝取胱氨酸生成半胱氨酸進而合成GSH，而GPX4 可在GSH 的存在下發(fā)揮磷脂過氧化物酶活性以催化脂質(zhì)過氧化物發(fā)生還原；因此，小分子抑制system Xc-可導致GSH 耗竭，間接使GPX4 失活，從而使ROS 水平升高，最終導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累并觸發(fā)鐵死亡。另外，也有文獻[9]指出GPX4 過表達可明顯抑制細胞鐵死亡 的發(fā)生。

此外，作為細胞質(zhì)和線粒體之間轉(zhuǎn)運離子和代謝物的跨膜通道，位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDACs）在鐵死亡中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，erastin 可作為VDACs 微管蛋白的拮抗劑以解除微管蛋白對VDACs 的抑制作用，從而促使大量氧化物釋放，引發(fā)ROS 依賴的線粒體功能障礙、生物能量衰竭和鐵死亡，而VDAC2/3 基因敲低可減少由erastin 誘導的鐵死亡的發(fā)生。在黑色素瘤細胞的erastin 誘導鐵死亡的過程中，上調(diào)并激活E3-連接酶Nedd4 可促進VDAC2/3 的泛素化降解，從而抑制鐵死亡。由此發(fā)現(xiàn)，Nedd4-VDAC2/3 是erastin 誘導鐵死亡過程中的重要負反饋信號通路。

1.3 鐵死亡的誘導劑和抑制劑

由于鐵代謝和脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的中心環(huán)節(jié)，因此影響鐵代謝和脂質(zhì)過氧化從而引起ROS 積累的分子可被認為是鐵死亡的誘導劑或抑制劑。研究[5,12]顯示，鐵死亡的誘導劑包括間接抑制GPX4 的system Xc-抑制劑，如erastin、sulfasalazine、sorafenib 和L-glutamate， 以 及 直接抑制GPX4 的RAS 選擇性致死蛋白3（RAS-selective lethality protein 3，RSL3）、ML162（molecular libraries 162）、altretamine 和FIN56 等。最近的一項研究[13]指出，鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）是泛醌（CoQ10）抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，因此FSP1 的小分子抑制劑也能通過抑制脂質(zhì)過氧化反應誘導鐵死亡的發(fā)生。常見的鐵死亡抑制劑包括抑制ROS 的ferrostatin-1（Fer-1）， 抑 制Fenton 反 應 的 去 鐵 胺（deferoxamine，DFO），激活system Xc－的β-巰基乙醇和細胞內(nèi)鐵螯合劑環(huán)匹羅司[5,12]。此外，另有研究[3,14]發(fā)現(xiàn)，在鐵死亡的過程中酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）、溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）和LOXs 等參與脂肪酸代謝反應，催化PUFAs發(fā)生雙加氧反應，在GPX4 失活誘導的鐵死亡中也發(fā)揮了重要作用。

2 鐵死亡在肝臟疾病中的作用機制

長期以來，肝臟鐵超載一直被認為是不同肝臟疾病的主要誘因之一。新近研究[1]表明，作為新的非典型細胞死亡類型，鐵死亡在多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

2.1 ALD

在ALD 的發(fā)展過程中Fe2+會發(fā)生大量積聚，而體外補充鐵元素也會加速ALD 的進展。過量的鐵和酒精均與肝臟疾病的高風險相關(guān)。有研究[6,15]表明，鐵死亡抑制劑可明顯減輕由酒精誘導的肝細胞死亡，且Fer-1 可顯著改善小鼠酒精性肝損傷。因此，鐵死亡在ALD 的進展中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

研究[16]顯示，過表達磷脂酸磷酸水解酶lipin-1 可促進三酰甘油的合成和脂肪酸的氧化，加速體內(nèi)鐵的積累并加重脂肪變性，進而促進鐵死亡和肝損傷的發(fā)生。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在相同酒精飲食的條件下，腸特異性Sirtuin1（Sirt1）敲除組小鼠相比于野生型組的肝臟炎癥和肝損傷明顯減輕，鐵死亡相關(guān)基因的表達受到抑制，繼而提示腸特異性敲除Sirt1 或可通過部分減輕鐵死亡而減輕ALD。此外，Hu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠線粒體外膜蛋白mitoNEET 基因可誘導脂肪脂聯(lián)素和回腸成纖維細胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15）的表達水平協(xié)同升高，抑制肝臟氧化應激及鐵超載，進而減輕酒精性肝損傷；進而提示脂聯(lián)素和FGF15 可能作為脂肪-腸-肝代謝關(guān)鍵協(xié)調(diào)因子，介導mitoNEET 敲除后對ALD 的保護作用。

2.2 NAFLD 和NASH

近年來NAFLD 和NASH 的全球發(fā)病率均持續(xù)升高。文獻[19]指出，肝臟鐵含量的增加可能是NAFLD 的重要致病因素，且過量的鐵可能通過增加肝細胞膨脹、炎癥和纖維化的風險加重NAFLD，從而使其轉(zhuǎn)化為NASH。作為抗氧化劑，維生素E 能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應，也能減輕NASH 患者的肝損傷程度[20-21]。除了脂質(zhì)過氧化，鐵代謝紊亂也是導致NASH 病情加重的因素之一。有臨床研究[20]顯示，部分NASH 患者出現(xiàn)了肝鐵質(zhì)沉著現(xiàn)象，原發(fā)性血色素沉著癥患者出現(xiàn)了NASH 加重現(xiàn)象等。因此，在NASH 的部分患者中有可能存在鐵死亡現(xiàn)象[20]。

Yang 等[22]發(fā)現(xiàn)，給予高鐵飲食會導致小鼠肝臟氧化應激和炎癥反應加重，引起肝損傷，從而加速NAFLD 向NASH 的進展。而鐵死亡抑制劑可明顯抑制模擬NASH發(fā)病的甲硫氨酸/ 膽堿缺乏飼料（methionine-choline deficient diet，MCD）模型或膽堿缺乏并添加乙硫氨酸飲食（choline-deficient，ethionine-supplemented diet，CDE）模型小鼠的肝細胞死亡和炎癥相關(guān)基因的表達[23-24]，這些均表明抑制鐵死亡可在NASH 進展過程中發(fā)揮潛在的治療作用。但目前，關(guān)于鐵死亡在NASH 中的作用及機制的報道較少，值得進一步研究。

2.3 肝纖維化

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展過程中的一個階段，長期持續(xù)的肝纖維化會演變成肝硬化。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活、增殖及轉(zhuǎn)化是肝纖維化過程中的重要環(huán)節(jié)，因此以HSC 作治療標靶或可為新的抗肝纖維化治療提供重要的理論意義。研究[25]顯示，青蒿琥酯可誘導活化的HSC，通過鐵自噬發(fā)生鐵死亡來抑制肝纖維化發(fā)展。異甘草酸鎂可通過上調(diào)血紅素氧合酶1 的表達調(diào)控鐵轉(zhuǎn)運過程，促進Fe2+和脂質(zhì)過氧化物累積，誘導HSC 發(fā)生鐵死亡，從而減輕肝纖維化程度[26]。此外，蒿甲醚可通過上調(diào)P53 的基因表達，抑制溶質(zhì)載體家族7成 員11（recombinant solute carrier family 7，member 11，SLC7A11）重組蛋白間接使GPX4 失活，最終誘導HSC發(fā)生鐵死亡，抑制肝纖維化的發(fā)生[27]。因此，針對鐵死亡調(diào)控機制的研究或?qū)楦卫w維化提供新的診斷和治療 方法。

2.4 病毒性肝炎

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染可通過不同的機制引起肝細胞鐵含量過載，如HCV 可誘導氧化應激抑制肝臟鐵調(diào)素從而導致十二指腸膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1 （ferroportin-1）上調(diào)等。研究[28]發(fā)現(xiàn)，HCV 患者的細胞內(nèi)鐵含量與該疾病的嚴重程度密切相關(guān)。同時，有研究[29]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）在HCV 感染肝細胞過程中可引起鐵代謝改變，從而增強病毒遺傳物質(zhì)的復制及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯。此外，使用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV 發(fā)現(xiàn)，在藥物處理24 h 后血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平急劇升高，細胞鐵和鐵蛋白水平亦進一步升高，這些動態(tài)變化可能與治療相關(guān)的病毒動力學有關(guān)[1]。

2.5 自身免疫性肝病

自身免疫性肝病是由免疫介導的不同組織損傷引起的一組慢性肝病，主要指以肝細胞為靶點的AIH[30]。AIH 是一種持續(xù)性的、復發(fā)性的由免疫反應介導的肝損傷。目前，引起AIH 的機制尚未被闡明，其中利用刀豆蛋白A （concanavalin A，ConA）導致的暴發(fā)性免疫肝損傷是AIH 最常用的模型。研究[30]表明，微囊蛋白（caveolin-1，CAV1）的基因被敲除可明顯促進由ConA 誘導產(chǎn)生的ROS 和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的大量累積，從而誘發(fā)更加嚴重的肝細胞鐵死亡和AIH。而吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1，IDO1）與鐵死亡抑制劑Fer-1 均可減輕ConA 誘導的鐵死亡和肝損傷[31-32]。這些數(shù)據(jù)均表明，鐵死亡可能在免疫介導的肝炎中發(fā)揮一定作用，靶向鐵死亡或?qū)⒊蔀橹委烝IH 的潛在靶點。

2.6 肝癌

研究[33]表明，鐵死亡誘導劑erastin 可明顯抑制HCC細胞中GA 結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子亞基-1（GA binding protein transcription factor subunit β 1，GABPB1）蛋白的表達，使得過氧化物酶基因表達受到抑制，從而導致胞內(nèi)ROS 和丙二醛不斷累積，引發(fā)細胞死亡。因此，GABPB1 可能是介導erastin 誘導的HCC 細胞鐵死亡的關(guān)鍵分子。此外，在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)長鏈?；o酶A 合成酶3（acyl-CoA synthetase long chain family member 3，ACSL3） 和ACSL4 表達顯著上調(diào)[33]，而ACSL4 可通過5- 羥基二十碳四烯酸介導的脂毒性在erastin 誘導的鐵死亡中發(fā)揮作用[4]。索拉非尼（Sorafenib）是目前唯一能夠通過誘導鐵死亡治療肝癌的抗癌藥物，但其耐藥性會在很大程度上影響其治療效果。而另有研究[34-35]表明，抑制金屬硫蛋白1G（metallothionein 1G，MT1G）和氧化應激相關(guān)蛋白sigma 1 受體（oxidative stress-related protein sigma 1 receptor，S1R）均可通過誘導鐵死亡過程來改善肝癌細胞對索拉非尼的耐藥問題。也有文獻[36]報道，索拉非尼可通過下調(diào)成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，RB）的表達提高肝癌細胞對鐵死亡的敏感性，從而增強其抗癌作用。最新的一項研究[37]證明，銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）通過調(diào)節(jié)HCC 細胞的鐵穩(wěn)態(tài)來抑制鐵死亡，而抑制CP 可顯著增加細胞內(nèi)Fe2+和ROS 的積累，進而促進erastin 和RSL3 誘導的HCC 細胞鐵死亡。因此，對肝癌患者進行聯(lián)合用藥治療或許可以解決部分耐藥性問題，從而提升其臨床效果。

同時，納米顆粒藥物也為原位誘導肝癌細胞鐵死亡提供了新的方向。文獻[38]報道顯示，錳-二氧化硅納米顆?？赏ㄟ^快速消耗胞內(nèi)的GSH 來誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡。由低密度脂蛋白-二十二碳六烯酸（low density lipoprteindocosahexaenoic acid，LDL-DHA）重組而成的納米顆?？商岣吒伟┘毎麅?nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，降低GSH 水平并抑制GPX4 的功能，從而誘發(fā)鐵死亡殺死肝癌細胞，抑制大鼠原位肝腫瘤的生長[4]。因此，誘導肝癌細胞發(fā)生鐵死亡可能是未來特異性治療肝癌的新方向。

3 總結(jié)與展望

鐵依賴的脂質(zhì)過氧化反應是鐵死亡的標志，但目前針對鐵死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的分子以及通用的信號通路尚未被闡明。鐵作為催化劑可將過氧化物轉(zhuǎn)化為自由基從而誘導鐵死亡，但該作用機制尚不清楚，也不能確定是否有其他代謝過程或其他形式的調(diào)節(jié)性細胞死亡參與了鐵死亡的調(diào)控。同時，作為調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)的重要的細胞死亡方式之一，鐵死亡還參與了多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。若正常肝細胞發(fā)生鐵死亡，將會導致細胞氧化還原代謝紊亂從而引起相應的病理生理學改變。而在肝癌細胞中增加其對鐵死亡的敏感性，則可通過降低腫瘤細胞的耐藥性提高治療效果。目前，已有的關(guān)于鐵死亡在肝臟疾病中作用的文獻報道多為間接研究，較難找到直接作用的靶點，而僅使用抗氧化劑抑制脂質(zhì)過氧化亦很難達到治療效果。因此，了解其具體的作用機制和因果關(guān)系對于分析鐵死亡在肝臟相關(guān)疾病中作用至關(guān)重要。近年來，以鐵死亡為方向進行疾病治療的研究快速發(fā)展，其或?qū)槲磥砼R床治療的方向和策略提供一定的參考。

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