張?jiān)?，周厚妊，羅語岑，辛瑩，劉小奇，劉治軍

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004；2沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院

分子靶向超聲造影是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，良好的超聲造影劑是實(shí)現(xiàn)分子靶向超聲造影的關(guān)鍵。在過去的幾十年里，超聲造影劑大多是載著特異性靶向抗體、藥物或基因的微泡，用于腫瘤或炎癥血管內(nèi)靶向診斷和治療，并且得到了廣泛的研究。然而，微泡的粒徑限制了其對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮間隙（380～780 nm）的穿透，使其不能更好地針對(duì)腫瘤細(xì)胞。因此，為實(shí)現(xiàn)靶向性血管外超聲分子成像，亟需納米級(jí)超聲造影劑［1］。自殺基因療法對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度選擇性，被認(rèn)為有可能成為一把潛在的對(duì)抗腫瘤的利器［2］。單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋（HSV-TK/GCV）是目前自殺基因療法中最為常用且成熟有效的，胸苷激酶（TK）基因是藥敏基因，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染該基因后，前體藥物丙氧鳥苷（GCV）或無環(huán)鳥苷（ACV）會(huì)變得敏感，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［3］。2019年1月—11月，本研究采用前期課題組制備的胍基化SS-PAAs類陽離子聚合物（AGMCBA）作為HSV-TK自殺基因的核定位載體［4-5］，再利用人上皮生長因子受體2（HER2）靶向納米超聲造影劑包裹作為基因的靶向載體，研究該納米超聲造影劑的理化特性和體外超聲顯影效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、生物素化二硬酯酰磷脂酰乙醇胺（Biotin-DSPE-PEG2000）購自美國Avanti公司；膽固醇（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；全氟己烷（PFH，Shangfluoro公司）；鏈霉親和素（美國Bioss公司）；HSV-TK（上海生工生物工程有限公司）；抗HER2抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）-抗HER2抗體（上海億欣生物科技有限公司）；Hochest33342、Cy5熒光染料（碧云天生物技術(shù)有限公司）；NCI-N87胃癌細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；PBS緩沖液（Solarbio公司）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司，美國）；湘儀H-1650高速離心機(jī)；脂質(zhì)體擠出器（LiposoFast，Avestin公司）；低功率聚焦超聲儀（重慶融海超聲醫(yī)學(xué)工程研究中心）；激光粒度儀及電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；SN3400掃描電子顯微鏡；激光共聚焦顯微鏡（德國）；電子天平（Sartorius公司）；恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；FACSAria流式細(xì)胞儀；KH5200DB型數(shù)控超聲波清洗器；超聲波診斷儀（PhilipsIU22）。

1.2 AGM-CBA／HSV-TK載體基因復(fù)合物的制備 AGM-CBA由前期課題組合成［4］。制備一定濃度AGM-CBA的PBS溶液，記為溶液A；另制備一定濃度HSV-TK質(zhì)粒的PBS溶液，記為溶液B。隨后分別將等體積不同濃度溶液A小心加入等體積溶液B中，輕輕混勻，37℃孵箱中孵育30 min制備得到載體/基因復(fù)合物。并取上述少許復(fù)合物溶液采用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)其粒徑。

1.3 載HSV-TK基因及PFH的納米超聲造影劑的制備以及基因在造影劑中包封率的測(cè)定 ①將制好的載體基因復(fù)合物放到4℃冰箱備用。②稱取8.8 mg DPPC、3.0 mg膽固醇、2.8 mg Biotin-DSPEPEG2000（DPPC∶膽固醇∶Biotin-DSPE-PEG2000的摩爾比為60∶40∶5），加無水乙醇2 mL，37℃水浴，攪拌使其溶解（溶解過程中用錫箔紙封住瓶口，防止蒸發(fā)）。將其置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以37℃旋蒸30 min，使磷脂/膽固醇的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇，氮?dú)獯蹈?0 min，制備脂質(zhì)膜。另取PBS緩沖液2 mL，置于小燒杯內(nèi)，37℃水浴中保溫，待用。將制備好的載體基因復(fù)合物加入上述PBS緩沖液中，再將包含載體基因復(fù)合物的PBS緩沖液加入制備好的脂質(zhì)膜中，轉(zhuǎn)動(dòng)下37℃水化30 min，即制得包載載體基因復(fù)合物的脂質(zhì)體。③取上一步驟中的脂質(zhì)體混懸液0.75 mL轉(zhuǎn)移至2 mL EP管內(nèi)，向EP管內(nèi)逐滴加入40μL PFH。在全程冰浴條件下，采用超聲波清洗器對(duì)EP管內(nèi)混合液進(jìn)行震蕩，頻率為80 Hz，時(shí)間設(shè)為16 min。④將混合液裝入離心管，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心2 min，去上清于聚乙烯管備用，然后向離心管加入PBS緩沖液，用漩渦振蕩器混勻，重復(fù)3次，以去除未結(jié)合的脂質(zhì)及PFH，最后得到乳白色的脂質(zhì)包裹載體基因復(fù)合物及PFH的造影劑。⑤將做成的脂質(zhì)體依次通過夾有1μm及400 nm的聚碳酸酯膜的擠出器，分別擠出21次，最終制得載有HSV-TK基因及PFH的納米超聲造影劑。⑥將造影劑置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩＂呱锨逡褐泻形窗谠煊皠┑妮d體/基因復(fù)合物，向裝有上清液的聚乙烯管中加入等體積的肝素鈉，37℃孵育30 min，即將復(fù)合物中的HSV-TK替換為肝素。采用酶標(biāo)儀測(cè)量復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長為510 nm、發(fā)射波長為595 nm。通過HSV-TK溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離基因的含量。造影劑對(duì)基因的包封率的計(jì)算公式［6］為包封率（%）=（投入量-游離量）/游離量×100%。

1.4 HER2靶向納米超聲造影劑的制備 取上述納米超聲造影劑100μL加入900μL的PBS溶液中稀釋；然后加入鏈霉親和素30μL（5 mg/mL），間斷輕微搖晃并將其置于4℃下靜置30 min后離心（12 000 r/min，2 min），去除上清液，PBS緩沖液洗滌3次，加入生物素化HER2抗體25μL（1μg/mL），輕輕搖勻后繼續(xù)放置于4℃冰箱中避光反應(yīng)30 min；反應(yīng)后取出混合液離心（12 000 r/min，2 min），去除上清，PBS緩沖液洗滌3遍，即制得HER2靶向納米超聲造影劑。

1.5 靶向納米超聲造影劑的基本特性鑒定及形態(tài)學(xué)觀察 取上述少許造影劑溶液置于掃描電子顯微鏡，觀察其形態(tài)及均一性；另取少許造影劑溶液，采用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)造影劑粒徑及電位。

1.6 HER2抗體與造影劑的連接情況檢測(cè) 取9μL的異硫氰酸熒光素—抗HER2抗體分別緩慢滴加于按上述方法制備好的非靶向超聲造影劑和HER2靶向超聲造影劑中，采用流式細(xì)胞儀分別對(duì)造影劑與HER2抗體連接前后進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.7 靶向納米超聲造影劑的核定位效應(yīng)實(shí)驗(yàn) HSVTK先用Cy5熒光染料標(biāo)記（Label IT?核酸標(biāo)記技術(shù)），再制備HER2靶向納米超聲造影劑。將課題組之前培養(yǎng)的NCI-N87胃癌細(xì)胞以2×105細(xì)胞/皿的密度接種在培養(yǎng)皿的蓋玻片上培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染研究前，將培養(yǎng)基更換為新鮮的無血清培養(yǎng)基。然后將100μL載有AGM-CBA／HSV-TK的靶向納米超聲造影劑的復(fù)合物添加到每個(gè)孔中，隨之用低頻超聲輻照。低頻超聲照射條件根據(jù)前期課題組優(yōu)化后設(shè)置為650 kHz，1.5 W/cm2，照射時(shí)間60 s。將NCIN87細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)4 h，并用PBS洗滌細(xì)胞3次。將8μg/mL的Hoechst 33342孵育以染色細(xì)胞核，然后用4%多聚甲醛（1.5 mL/皿）固定30 min，最后使用激光共聚焦顯微鏡來分析該造影劑的核定位作用。

1.8 體外顯影實(shí)驗(yàn) 以制備的靶向納米超聲造影劑為實(shí)驗(yàn)組，以超純水為對(duì)照組，以巴氏滴管作為體外模型。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品吸入滴管中，使用PhilipsIU22彩色超聲診斷儀，采用造影模式（L9-3/Cont Gen），熱指數(shù)（TIS）為0，機(jī)械指數(shù)（MI）為0.13進(jìn)行超聲造影成像。

2 結(jié)果

2.1 AGM-CBA/HSV-TK載體基因復(fù)合物的粒徑 馬爾文激光粒度儀顯示，AGM-CBA/HSV-TK載體基因復(fù)合物的粒徑為（96.73±1.27）nm。

2.2 HSV-TK基因在超聲造影劑中的包封率 HSV-TK基因在超聲造影劑中的包封率約為63%。

2.3 靶向納米超聲造影劑的形態(tài)特征 在宏觀狀態(tài)下，超聲造影劑溶液呈乳白色，不透明，靜置一段時(shí)間后沒有明顯的分層現(xiàn)象；掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，造影劑呈球形，表面較光滑，大小均一，形態(tài)規(guī)則；馬爾文激光粒度儀顯示粒徑為（550.93±10.19）nm，Zeta電位為（-9.75±0.74）mV。

2.4 HER2抗體與造影劑的連接情況 非靶向超聲造影劑熒光抗體結(jié)合率為0.04%，靶向超聲造影劑熒光抗體結(jié)合率為50.24%，抗體與脂質(zhì)體成功連接。

2.5 靶向納米超聲造影劑的核定位效應(yīng) 經(jīng)過4 h的轉(zhuǎn)染，大部分細(xì)胞均能觀察到紅色熒光，表明HSV-TK成功遞送至細(xì)胞中。

2.6 體外顯影效果 超聲造影成像結(jié)果顯示，靶向納米超聲造影劑回聲明顯增強(qiáng)，并表現(xiàn)為細(xì)膩均勻的點(diǎn)狀密集高回聲；超純水則為無回聲。

3 討論

分子影像學(xué)的出現(xiàn)是醫(yī)學(xué)影像學(xué)發(fā)展的一個(gè)里程碑，超聲造影劑作為分子成像的一個(gè)重要組成部分，在臨床試驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用，擴(kuò)展了傳統(tǒng)成像模式的診斷能力和實(shí)用價(jià)值。與微米尺寸的超聲造影劑相比，納米級(jí)別的造影劑更適合于靶向分子成像，且其尺寸更小，更可能作為治療手段，已成為近年來的研究熱點(diǎn)［7-8］。納米級(jí)超聲造影劑中，脂質(zhì)體外殼包裹氟碳化合物形成的納米泡成像效果最好。DPPC及DSPE是兩種合成磷脂，是許多細(xì)胞膜的主要磷脂成分，具有良好的生物相容性，膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用。故本研究采用薄膜水化機(jī)械振蕩法，以合成磷脂（DPPC、DSPE）、膽固醇為成膜材料制備脂質(zhì)體超聲造影劑。掃描電鏡下見造影劑納泡呈球形，形態(tài)規(guī)則，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定粒徑為（550.93±10.19）nm，其能穿透腫瘤血管內(nèi)皮間隙，使在血管外超聲分子成像成為可能。

本研究以前期課題組構(gòu)建的聚合物AGM-CBA作為HSV-TK的核定位載體，該聚合物具備將不同質(zhì)粒DNA壓縮為納米級(jí)基因/載體復(fù)合物的能力，能夠?qū)|(zhì)粒DNA實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定包載，保護(hù)其不被核酸酶降解；形成的載體基因復(fù)合物主要通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞，同時(shí)入胞后被包載的質(zhì)粒DNA有很好的釋放效率。既往研究結(jié)果表明，其細(xì)胞毒性更低，轉(zhuǎn)染效率更高，表現(xiàn)出優(yōu)良的核定位效應(yīng)［9-10］，具有良好的應(yīng)用前景。

超聲造影劑接靶方法有多種，如共價(jià)偶聯(lián)法、吸附法等。其中，“生物素—親和素橋接法”是目前應(yīng)用最為廣泛的接靶方法。該方法不僅操作簡便、接靶效率高，而且連接牢固。生物素與親和素之間以非共價(jià)鍵結(jié)合，所以也是目前已知最強(qiáng)的一種結(jié)合粘連系統(tǒng)［11-12］。鏈霉親和素是一種類似于親和素的蛋白質(zhì)，它有四個(gè)亞基能夠與生物素連接，每個(gè)亞基可以結(jié)合一個(gè)生物素分子，因而其親和力高于親和素，且價(jià)格低廉。本研究應(yīng)用該方法，以在許多腫瘤中都有過表達(dá)抗原HER2為靶點(diǎn)，利用鏈霉親和素將生物素化HER2抗體和Biotin-DSPE-PEG2000非共價(jià)鍵結(jié)合，成功制備出HER2靶向超聲造影劑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其連接率較理想。但與傳統(tǒng)超聲造影劑相比，靶向納米超聲造影劑是否有更好的穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步研究。

自殺基因療法是一種非常具有前景的腫瘤治療方法，自殺基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并在合適的底物存在下誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，參與這一過程的另一種機(jī)制是旁觀者效應(yīng)，即轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的有毒代謝物被轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。HSV-TK/GCV系統(tǒng)是目前最常用的自殺基因治療系統(tǒng)之一，HSV-TK自殺基因的表達(dá)可導(dǎo)致胸苷激酶的產(chǎn)生，這種酶可將GCV單磷酸化，細(xì)胞激酶將無毒的單磷酸化GCV轉(zhuǎn)化為有毒的GCV三磷酸，即脫氧鳥苷三磷酸類似物，它可以抑制DNA聚合酶并破壞DNA合成［13-15］。故本研究通過構(gòu)建一種攜帶HSV-TK自殺基因的脂質(zhì)超聲造影劑，以期成為傳遞抗腫瘤基因的有效載體，自殺基因的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果將在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步考察。

液態(tài)氟碳類造影劑在體內(nèi)顯像方面存在更多優(yōu)勢(shì)，如更低的毒理學(xué)危險(xiǎn)度、更長的組織內(nèi)循環(huán)時(shí)間及可更加持久的抵抗外界壓力和機(jī)械應(yīng)力的變化［16］。PFH作為一種安全無毒的液體，具有相轉(zhuǎn)變特性。有研究表明將PFH包裹在納米粒中，利用其相轉(zhuǎn)變特性瞬間釋放能量，可殺傷腫瘤［17-18］。并且，氣化后的PFH可形成微米級(jí)氣泡，仍具備增強(qiáng)回聲信號(hào)的能力。故本研究采用PFH作為脂質(zhì)體超聲造影劑的顯像內(nèi)核，并且體外顯影效果理想。

綜上所述，本研究制備了一種以HER2為靶點(diǎn)同時(shí)載有HSV-TK基因且具有核定位效應(yīng)的納米超聲造影劑，其大小分布均勻，形態(tài)規(guī)則，且有良好的體外超聲顯影效果。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了一定基礎(chǔ)。