王小寧，閆夢茹，梁曉燕，高迎春，馬遠濤

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，主要應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌等的化療，其療效確切，但選擇性差，心臟毒性嚴重，長期應(yīng)用可發(fā)生劑量依賴性的不可逆轉(zhuǎn)心肌病變，并造成骨髓抑制，使DOX的臨床應(yīng)用受到極大限制[1-2]。因此，提高DOX的腫瘤靶向性是目前亟待解決的問題。近年來，配體-受體模式的主動靶向給藥系統(tǒng)備受關(guān)注，葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)在許多人類實體腫瘤(卵巢癌、腎癌、子宮癌、結(jié)腸癌、肺癌)細胞表面過度表達，但在正常組織表達率很低，因此，利用葉酸(folic acid，F(xiàn)A)修飾藥物或藥物載體，通過與葉酸受體特異結(jié)合可將藥物靶向投遞到腫瘤組織[3-4]。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是一種以室溫下為固態(tài)的天然或合成的脂質(zhì)或類脂，如卵磷脂、三酰甘油等為基質(zhì)，將藥物包裹于類脂核中制成粒徑約為50～1 000 nm的固體脂質(zhì)微粒給藥體系[5-6]。固體脂質(zhì)納米粒的固體脂質(zhì)形式有效解決了脂質(zhì)體藥物易滲漏的缺點，又避免了作為藥物載體的物理不穩(wěn)定性。同時，采用人體耐受良好的脂質(zhì)材料，制備過程中不會引入有毒物，其生物相容性更好，毒性更低[7]。因此，固體脂質(zhì)納米粒是一種具有發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)。

聚(2-乙基-2-噁唑啉)[poly(2-ethyl-2-oxazoline),PEOz]是一種親水性高分子材料，可以修飾在納米粒子表面，增加其親水性，形成立體位阻，使納米粒躲過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識別，避免被攝取清除，因此能夠達到延長藥物體內(nèi)循環(huán)時間的目的[8]。同時，PEOz具有pH響應(yīng)性，其分子中含有叔酰胺基團，容易結(jié)合溶液體系中的氫離子發(fā)生質(zhì)子化，在酸性條件下，由于質(zhì)子化后產(chǎn)生的靜電斥力會使得PEOz鏈舒張，造成藥物釋放[9]。因此，作者制備一種葉酸與PEOz共同修飾的pH響應(yīng)型固體脂質(zhì)納米制劑(SLN-PEOz-FA)作為新型的給藥系統(tǒng)，以DOX為模型藥物，采用薄膜分散法制備載藥固體脂質(zhì)納米粒(DOX@SLN-PEOz-FA)，考察其包封率、載藥量、粒徑、體外釋藥性能，以人乳腺癌細胞(MCF-7)為細胞模型考察腫瘤細胞生長抑制率及細胞攝取情況，為腫瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DOX：純度>99%，美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸多巴胺：純度>99%，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、青霉素-鏈霉素(10000IU/mL青霉素-G和10 mg/mL鏈霉素)、含有各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液)，美國Hyclone公司；泊洛沙姆188、單硬脂酸甘油酯、注射用大豆卵磷脂：藥用級，天津市博迪化工有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

電子天平：SQP，德國賽多利斯公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：ZNCL-T1000，西安予輝儀器有限公司；臺式低速離心機：WTL-6K，湖南湘儀儀器有限開發(fā)公司；超聲波清洗器：KQ520E，昆山市超聲儀器有限公司；真空干燥箱：DZF6050，溫州鼎力醫(yī)療器械有限公司；激光粒度分析儀：Malvern，英國馬爾文儀器有限公司；紫外-可見分光光度計：Cary60，安捷倫科技有限公司；酶標儀：680，美國BIO-RAD；倒置熒光顯微鏡：ix73，日本奧林巴斯公司。

1.2 固體脂質(zhì)納米粒的制備

1.2.1 DOX@SLN的制備

采用薄膜分散法進行阿霉素固體脂質(zhì)納米粒制備[10]。油相制備：精密稱取大豆卵磷脂40 mg溶解于30 mL無水乙醇中，稱取單硬脂酸甘油酯0.12 g在60 ℃下加熱熔融，與上述溶液混合；水相制備：精密稱取DOX 9 mg加入到20 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的泊洛沙姆188溶液中；將油相置于250 mL的茄型瓶中，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到油膜，加入20 mL的水相，超聲處理40 min(功率為400 W)，得到SLN混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DOX@SLN-PEOz的制備

將制得的固體脂質(zhì)納米粒取14 mL加入14 mg的鹽酸多巴胺，加入2 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用w(NaOH)=0.1%溶液調(diào)節(jié)至pH=8.5，在室溫條件下避光攪拌24 h后，反應(yīng)結(jié)束。繼續(xù)加PEOz 5 mg在室溫下避光攪拌2 h，即可得到PEOz修飾的固體脂質(zhì)納米粒，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DOX@SLN-PEOz-FA的制備

取PEOz修飾的固體脂質(zhì)納米粒7 mL置于燒杯中，避光稱取5 mg葉酸加入，避光攪拌2 h，即可得到葉酸和PEOz共同修飾的DOX固體脂質(zhì)納米粒，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 含量測定方法學(xué)考察

精密稱取DOX 10 mg置于100 mL的容量瓶中，加去離子水完全溶解至刻度，作為標準儲備液。分別精密量取該溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL置于10 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，得到一系列質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μg/mL的標準液，在480 nm處測定吸光度，用吸光度A對質(zhì)量濃度ρ作標準曲線，同時進行精密度、重復(fù)性及加樣回收率考察。

1.3 粒徑和Zeta電位

分別取1 mg DOX@SLN、DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA，用去離子水稀釋至10 mL，吸取2 mL稀釋液加入激光粒度儀的樣品池中，測定平均粒徑及表面電位。

1.4 包封率和載藥量

吸取2 mL DOX@SLN-PEOz-FA,在4 ℃條件下5 000 r/min離心40 min，分離上清液，吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，用去離子水稀釋定容，搖勻。以相同條件下制得的空白納米粒的上清液為參比對照，在480 nm處測定吸光度，計算上清液中游離DOX的含量，按照公式(1)、(2)計算包封率和載藥量。

包封率=[m(總DOX)-m(上清液中游離的DOX)]/m(總DOX)×100%

(1)

載藥量=[m(總DOX)-m(上清液中游離的DOX)]/m(納米粒)×100%

(2)

1.5 載藥納米粒的體外釋放實驗

分別精密移取SLN@DOX、DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA各3份，每份吸取1 mL，加入到預(yù)先處理好的透析袋中，扎緊透析袋兩端，懸浮于20 mL pH=5.0、6.5、7.4的PBS中，將其置于37 ℃恒溫水浴鍋中動態(tài)透析，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48 h取透析袋外液1 mL，同時補充等量新鮮的PBS。測定樣品吸光度值，依據(jù)公式(3)計算累計釋放度(Q)。

(3)

式中：ρn為不同取樣點時的釋放液質(zhì)量濃度，μg/mL；ρi為取樣點時取樣質(zhì)量液濃度，μg/mL；V為釋放介質(zhì)體積，mL；Vi為取樣體積，mL；m為總藥量，μg。

1.6 細胞攝取實驗

將MCF-7細胞3×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液漂洗，加入2 mL無血清培養(yǎng)液稀釋的游離DOX溶液、DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA，使DOX的最終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。繼續(xù)孵育4 h，孵育完畢后，吸棄含藥培養(yǎng)液，用冷的PBS漂洗3次，除去未進入細胞的藥物，然后加入w(多聚甲醛)=4%溶液，每孔1 mL，然后將細胞放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)30 min后，在超凈臺內(nèi)吸去多聚甲醛溶液，用PBS清洗細胞3～5次，以清除多余的多聚甲醛，然后每孔加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(0.5 μg/mL)溶液1 mL，將細胞放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)15 min后，吸去DAPI溶液，用PBS清洗細胞3～5次，每孔加入500 μL，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照，考察細胞攝取的變化情況。

1.7 體外細胞生長抑制率研究

將對數(shù)生長期的MCF-7細胞進行消化得到混懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)后接種于96孔板，接種的細胞密度為5×104個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)24 h。加入含有不同質(zhì)量濃度載藥粒子(游離DOX、DOX@SLN、DOX@SLN-PEOz、DOX@SLN-PEOz-FA)的培養(yǎng)液200 μL，使ρ(DOX)=125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0和1.0 μg/mL，實驗同時設(shè)空白對照組。每孔6復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入ρ(MTT)=5 g/L溶液150 μL，于37 ℃、φ(CO2)=5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩器上輕搖10 min，結(jié)晶溶解后，在酶標儀490 nm波長處測出細胞對照組和各實驗組的吸光度A，以每孔6個孔的平均值作為各組的吸光度，重復(fù)實驗3次，計算各實驗組的存活率=A實驗組/A對照組×100%，比較各個實驗組在24 h后對MCF-7細胞的存活率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 含量測定方法學(xué)

以DOX標準液的質(zhì)量濃度ρ為橫坐標x，吸光度A為縱坐標y，得回歸方程為y=19.58x+0.007，R2=0.999 7，ρ(DOX)=0.002～0.040 mg/mL線性關(guān)系良好。精密度及穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，吸光度RSD<5%，精密度、穩(wěn)定性符合要求，加樣回收率實驗結(jié)果表明，在低、中、高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，回收率均為90%～110%，回收率良好。

2.2 粒徑、分布及電位值

各載藥制劑的粒徑、分布及電位值見表1。

表1 各載藥制劑的粒徑、PDI和Zeta電位值

由表1可知，隨著PEOz和FA的修飾，納米粒子的粒徑逐漸增大，粒徑分布較為集中。DOX@SLN的Zeta電位值為-19.6 mV，PEOz修飾后，Zeta電位值為-13.8 mV，這可能是由于PEOz上有叔胺基引起，經(jīng)FA修飾后，Zeta電位值為-18.4 mV，這是由FA上的羧基引起的。

2.3 載藥量和包封率

按照1.4方法，計算載藥量和包封率，得到結(jié)果見表2。

表2 各載藥制劑的載藥量和包封率

由表2可知，3種載藥制劑的包封率均超過90%，為92.46%～94.17%，載藥量為6.46%～9.31%。

2.4 體外釋藥

根據(jù)1.5方法進行體外釋藥實驗，計算累計釋放度(Q)，其釋放結(jié)果見圖1。

t/ha DOX@SLN-PEOz-FA在不同pH值釋放介質(zhì)中的釋放

t/hb 3種制劑在pH=5.0下的釋放圖1 體外釋放結(jié)果(n=3)

由圖1a可知，DOX@SLN-PEOz-FA的釋藥具有明顯的pH響應(yīng)性，其在pH=7.4的釋放介質(zhì)中釋藥緩慢，24 h累積釋放度為16.04%；在pH=6.5的介質(zhì)中，釋藥加快，24 h累積釋放度為40.62%；在pH=5.0的釋放介質(zhì)中，釋藥速率最快，4 h累計釋放度達到了35.28%，24 h累積釋放度為65.24%，這可能是由于PEOz結(jié)構(gòu)中叔胺基的質(zhì)子化造成PEOz鏈的“膨脹”，從而使得藥物快速釋放。由圖1b可知，經(jīng)PEOz修飾后，載藥制劑的釋藥均具有pH響應(yīng)性，且DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA之間釋藥速率沒有顯著性差異。DOX@SLN-PEOz-FA的pH響應(yīng)性釋藥特性有望實現(xiàn)藥物在腫瘤細胞內(nèi)的快速響應(yīng)釋放。

2.5 細胞攝取實驗

MCF-7細胞對不同載藥粒子的攝取結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與游離DOX相比，DOX@SLN的細胞攝取率明顯降低，這是由于DOX進入細胞是直接入核的。而DOX@SLN-PEOz-FA具有最高的細胞攝取，其在細胞內(nèi)的熒光強度比DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz顯著增強，說明SLN經(jīng)FA修飾后，確實增強了MCF-7細胞的攝取，這是由受體-配體特異性識別的主動靶向作用引起的[11]。細胞攝取增強有助于其特異性作用于腫瘤細胞，從而增強對腫瘤細胞生長的抑制。

2.6 體外細胞生長抑制率研究

載藥制劑對MCF-7細胞生長抑制率結(jié)果見圖3，各載藥制劑的IC50值見表3。

ρ/(μg·mL-1)圖3 載藥制劑對MCF-7細胞生長抑制率結(jié)果

表3 各載藥制劑的IC50值

由圖3可知，隨著藥物質(zhì)量濃度的逐漸增大，各組載藥制劑對細胞的抑制率增強。相同質(zhì)量濃度下的DOX@SLN-PEOz-FA對腫瘤細胞生長的抑制率比DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz組更高，說明經(jīng)葉酸和PEOz修飾后，載藥制劑對腫瘤細胞生長的抑制作用更強。由表3可知，DOX@SLN-PEOz的IC50值為6.20 μg/mL，與DOX@SLN之間存在顯著性差異(P<0.001)，這可能是由于PEOz修飾后釋藥速率加快，與體外釋藥結(jié)果一致，DOX@SLN-PEOz-FA的IC50最低，為3.36 μg/mL，與游離DOX、DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz之間均存在顯著性差異(P<0.001)，說明經(jīng)PEOz和FA雙重修飾后，對腫瘤細胞生長的抑制作用最強，這是由于細胞攝取增強及胞內(nèi)響應(yīng)釋藥雙重作用引起的。

3 結(jié) 論

(1)采用FA和PEOz對固體脂質(zhì)納米粒進行修飾，制得的固體脂質(zhì)納米粒平均粒徑為(245.46±47.48)nm，包封率為(92.46±5.30)%，載藥量為(4.46±0.17)%，體外釋藥特性研究結(jié)果表明，DOX@SLN-PEOz-FA具有明顯的pH響應(yīng)性；

(2)細胞攝取研究結(jié)果表明，與DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz相比，DOX@SLN-PEOz-FA的細胞攝取顯著增強，說明經(jīng)FA修飾后，載體的入胞能力顯著增強。體外腫瘤細胞生長抑制率研究結(jié)果表明，經(jīng)PEOz和FA共同修飾的SLN增加了DOX的細胞毒性，腫瘤細胞的生長明顯得到抑制。