翁艷潔 周曉水 王常玉 項 濤

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而位居第 3 位，但病死率卻位居各類婦科腫瘤的首位?；熌退帯⒛[瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移是卵巢癌預后不良的關(guān)鍵因素，腫瘤干細胞在其中起重要作用[1]。卵巢癌也被認為是腫瘤干細胞導致的疾病[2]。研究卵巢癌干細胞具有重要的科研價值和臨床意義[3]。目前卵巢癌干細胞的識別和分離大多采用腫瘤干細胞標志物的方法，例如 CD44、CD133、CD117、CD24、ALDH1或 MyD88等，可能與腫瘤干細胞的異質(zhì)性有關(guān)[4～8]。卵巢癌中CD90也可能是一種十分重要的腫瘤干細胞標志物[9]。筆者將對 CD90 是否可作為卵巢癌干細胞篩選的分子靶標進行分析，研究 CD90+卵巢癌細胞是否具有腫瘤干細胞的干性特征。

材料與方法

1.細胞培養(yǎng)：人卵巢癌順鉑耐藥細胞 SKOV3-MD3 的制備：向5～6周齡雌性裸鼠腿部注射 SKOV3 細胞1×106/100μl，7天后腹腔注射3mg/kg的順鉑(美國Sigma公司)，每3天1次，共治療8次后處死小鼠，取出瘤塊，消化成單細胞再次打入其他小鼠腿部，重復上述實驗 2 次，得到 SKOV3-MD3 順鉑耐藥株。

人卵巢癌細胞株 SKOV3 購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。SKOV3及SKOV3-MD3以含10% (質(zhì)量分數(shù))胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)于5%CO2、37℃、95% 濕度條件下孵箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)，3～4天傳代1次。

CD90+卵巢癌細胞用無血清的 DMEM/F12(1∶1)(美國Gibco公司) 培養(yǎng)，其中添加20ng/ml EGF(美國PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美國PeproTech公司)、5μg/ml 胰島素(美國Sigma公司)、B27(1∶50)(美國Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美國Millipore公司)。

2.CD90+細胞和 CD90-細胞分選：收集貼壁培養(yǎng)的 SKOV3-MD 細胞，預冷 PBS 沖洗 2 次后加入 FITC 標記鼠抗人 CD90 抗體(美國BD公司)，37 ℃孵育1h。預冷PBS沖洗2次，采用BD FACSAria Ⅱ流式分選儀對CD90+和 CD90-細胞進行分選。

3.自我更新能力鑒定：體外懸浮球形成能力：分別將上述分選獲得的CD90+和 CD90-兩組細胞用干細胞培養(yǎng)基 DMEM/F12(1∶1)(美國Gibco公司) 懸浮培養(yǎng)，其中添加20ng/ml EGF(美國PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美國PeproTech 公司)、5μg/ml胰島素(美國Sigma公司)、B27(1∶50)(美國Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美國Millipore公司)進行有限稀釋，保證10 個細胞/毫升的濃度，種入 96 孔低黏附孔板中(每孔200μl)，在顯微鏡下標注僅有1個細胞的孔，共培養(yǎng)14天，比較 CD90+和 CD90-細胞懸浮球形成的比例以及成球大小。

4.RT-PCR 檢測干細胞標志物表達：分別提取CD90+和CD90-細胞總 RNA，3μg RNA 合成 cDNA。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃ 1min；56℃ 30s；72℃ 30s 30個循環(huán),72℃延伸10min。引物：Nestin上游引物：5′-AGCCCAACGTACACCCCGAT-3′，下游引物：5′-CCCCAGAACCCAACTCCTCC-3′；Sox2上游引物：5′-TACCTCTTCCTCCCACTCCA-3′，下游引物：5′-GGTAGTGCTGGGACATGTGA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物：5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′。引物均由上海英駿生物有限公司合成。運用Chemi Imager 5500軟件對各條帶進行灰度分析, 以各基因和GAPDH積分灰度值的比值作為相對表達量，比較各基因 mRNA 水平表達情況。

5.動物成瘤實驗：人卵巢癌非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下移植瘤模型的建立: 每只 NOD/SCID 雌性小鼠(年齡5周)接種的細胞數(shù)量：CD90+和CD90-細胞分別為100、1000、10000個/只。每組細胞用50μl PBS稀釋，與等體積Matrigel混合均勻。在小鼠左側(cè)面淋巴結(jié)處皮下各注射100μl細胞懸液，次日記為接種第1天。注射后每天換墊料，每周觀察1次腫瘤形成及接種部位有無紅腫、潰破。記錄3個月以內(nèi)的皮下成瘤情況和動物生存狀況。實驗動物由上海市腫瘤研究所實驗病理中心提供。小鼠隨機分組，每組 6 只小鼠。

結(jié) 果

1.人卵巢癌細胞SKOV3-MD3中CD90+細胞比例：流式細胞儀鑒定人卵巢癌細胞SKOV3-MD3中CD90+比例為5.3%±0.9%，詳見圖1。

圖1 SKOV3-MD3中CD90+細胞比例

2.CD90+細胞自我更新能力高于CD90-細胞：單個CD90+細胞有分裂能力，可以在7天形成懸浮克隆球，并且可以連續(xù)傳代3次，說明CD90+細胞具有自我更新能力。單個 CD90-細胞增殖能力較慢，14天形成較小的懸浮克隆球，說明有一定的分裂能力。單個CD90+細胞和 CD90-細胞懸浮球形成率分別為68.0%±6.3%和18.0%±4.5%，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.22，P<0.01，圖2)。

圖2 單個CD90+細胞和CD90-細胞自我更新能力A.單個CD90+細胞和CD90-細胞懸浮球形成率；B、C分別為單個CD90+ 細胞和CD90-細胞體外懸浮球圖片(×200)

3.CD90+細胞體外分化潛能高于CD90-細胞：分別將CD90+細胞和CD90-細胞形成的懸浮克隆球細胞體外培養(yǎng)，用CD90單克隆抗體對細胞染色，流式細胞儀再次鑒定兩組懸浮克隆球中CD90+細胞和CD90-細胞的比例。結(jié)果顯示，單個CD90+細胞形成的克隆球細胞中含有CD90+和CD90-兩種細胞，說明單個CD90+細胞可以分化形成CD90+細胞和CD90-細胞，具有分化潛能。單個CD90-細胞形成的克隆球細胞中只含有CD90-細胞，無分化潛能，詳見圖3。

圖3 CD90+細胞和CD90-細胞分化潛能鑒定A、C.對照組細胞；B、D.CD90單抗染色細胞；A、B.CD90+ 克隆球細胞；C、D.CD90-克隆球細胞

4.CD90+細胞和CD90-細胞在 RNA 水平干細胞標志物的相對表達水平：T-PCR 結(jié)果顯示，在 RNA 水平，CD90+細胞表達干細胞標志物 Nestin和 Sox 2均明顯高于CD90-細胞，差異有統(tǒng)計學意義(tNestin=7.12,tSox 2=7.07,P<0.01)，詳見圖4。

圖4 CD90+細胞和CD90-細胞干性標志物相對表達

5.CD90+細胞在NOD/SCID 小鼠形成皮下移植瘤的能力高于CD90-細胞：體內(nèi)實驗顯示，CD90+細胞最低成瘤數(shù)是100個細胞，成瘤時間是8周。CD90-細胞組最低成瘤細胞數(shù) 1×104個細胞，成瘤時間是8周，詳見表1。CD90+與CD90-細胞成瘤能力存在明顯的指數(shù)級差異，且差異有統(tǒng)計學意義(t100=3.26，t1000=6.51，t10000=12.20，P<0.05)。

表1 CD90+細胞和CD90-細胞在NOD/SCID小鼠中皮下成瘤能力

討 論

卵巢癌5年生存率僅30%左右，嚴重威脅廣大女性的健康[10～12]。卵巢癌中以上皮性癌最多見，而漿液性癌是最常見的上皮性卵巢癌。高級別漿液性腺癌是病死率最高的類型，腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)及化療耐藥是其預后不良的主要因素。

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)也稱為腫瘤起始細胞(tumor initiating cell, TIC)，是腫瘤中具有自我更新和多向分化潛能的一種癌細胞亞群，與腫瘤的復發(fā)與耐藥密切相關(guān)。Hamburger 等在 1977 年證實了卵巢癌干細胞(ovarian cancer stem cells，OCSC)的存在。由于卵巢癌病理類型復雜，目前分選卵巢癌干細胞的細胞表面標志尚無統(tǒng)一報道，最常見的包括 CD44、CD117、CD133、CD24、ALDH1、MyD88 等。如何識別及獲得卵巢癌干細胞仍是研究的重點和難點。筆者既往的研究發(fā)現(xiàn)，可通過富集耐藥細胞群的方式來篩選卵巢癌干細胞，且發(fā)現(xiàn)化療藥物富集的卵巢癌細胞SKOV3-MD3較SKOV3細胞不僅對順鉑的耐藥性增加，還高表達CD90，提示CD90可能是卵巢癌干細胞篩選的分子學標志物之一。

CD90是一個25～37 kDa膜表面錨定蛋白，在骨髓來源的間質(zhì)干細胞、肝癌干細胞、造血干細胞、角化干細胞、乳腺癌干細胞、胃癌干細胞及腦膠質(zhì)瘤干細胞中均有表達[13～18]。有研究報道證實，CD90+SKOV3卵巢癌細胞的干細胞標志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog及Oct4表達水平均明顯高于CD90-細胞；CD90+細胞能夠促進卵巢癌細胞腹腔播散[5，6]。有研究報道，CD90+SKOV3細胞表達干細胞標志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog 及Oct4 均明顯高于CD90-SKOV3細胞[10,11]。但CD90是否可以作為卵巢癌干細胞篩選的分子學標志物仍需要進一步提供理論證據(jù)。為了更好地獲得卵巢癌干細胞，本實驗室通過順鉑藥物動物體內(nèi)富集的方法獲得了人卵巢癌順鉑耐藥細胞株 SKOV3-MD3。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，單個CD90+SKOV3-MD3卵巢癌細胞在體外培養(yǎng)7天可以形成克隆球，且可以連續(xù)傳代3次，說明CD90+卵巢癌細胞具有自我更新能力；將單個CD90+形成的克隆球細胞分析后發(fā)現(xiàn)，單個CD90+卵巢癌細胞可以再次分化出CD90+和CD90-細胞，說明 CD90+細胞具有分化能力，而CD90-卵巢癌細胞沒有分化能力；CD90+卵巢癌細胞高表達干細胞標志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog、Oct4、Nestin和Sox。在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤實驗中，100個CD90+卵巢癌SKOV3-MD3可以在 8 周形成腫瘤，表現(xiàn)出較高的體內(nèi)成瘤能力；10000個CD90-SKOV3-MD3 細胞只有1只小鼠可以皮下成瘤。動物實驗結(jié)果提示，CD90+卵巢癌細胞與CD90-卵巢癌細胞在成瘤能力中具有顯著的指數(shù)級差異，差異有統(tǒng)計學意義。綜合上述所有結(jié)果可知，CD90+卵巢癌細胞具有干細胞特性，CD90可能是卵巢癌干細胞的分子學標志物。

綜上所述，通過分析CD90+卵巢癌細胞的干性特征，不僅進一步證實了 CD90在分選卵巢癌干細胞中的可行性以及卵巢癌干細胞的異質(zhì)性，還有利于深入研究卵巢癌的分子分型及卵巢癌細胞的耐藥性及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學特性[19]，對于揭示卵巢癌的耐藥機制，尋找新的分子干預靶點具有十分重要的研究價值。