常昆鵬 魏珍星 李 斐 張 煒

鼻咽癌是臨床較多見的惡性腫瘤之一，與EB病毒感染有關(guān)，男性的發(fā)生率是女性的2倍[1]。近年來，對(duì)鼻咽癌的診治手段有了顯著進(jìn)步，然而鼻咽癌的易復(fù)發(fā)和易轉(zhuǎn)移導(dǎo)致部分患者的預(yù)后仍不理想[2]。早期發(fā)現(xiàn)、治療及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移對(duì)鼻咽癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200nt的非編碼RNA分子，位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，并不具有生物學(xué)功能[3]。近年來研究表明，lncRNA參與基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)雀鞣N生理過程, 與鼻咽癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[4～6]。CTA-246H3.12全長(zhǎng)747nt，是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，但CTA-246H3.12在疾病方面特別是鼻咽癌的研究鮮有報(bào)道。本研究通過檢測(cè)鼻咽癌組織和細(xì)胞系中CTA-246H3.12的表達(dá)水平, 進(jìn)一步分析上調(diào)CTA-246H3.12影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。

材料與方法

1.組織標(biāo)本、細(xì)胞系和主要試劑：收集2016年9月～2018年7月筆者醫(yī)院耳鼻喉科33例活檢切除鼻咽癌組織，其中男性18例，女性15例，患者年齡31～54歲，平均年齡47.28±7.26歲。按照鼻咽癌WHO 病理分型(2005)版進(jìn)行分型，角化癌13例，非角化性癌20例。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)鼻咽癌TNM分期系統(tǒng)(2010年第7版)對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例。選取2017年8月～2018年5月33例慢性鼻咽炎患者的鼻咽黏膜組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書，所有患者均未行術(shù)前放療和化療，所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后兩名以上病理科醫(yī)生確診。鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1) 和人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，RPMI 1640培養(yǎng)基、K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，攜有無意義序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒和攜有CTA-246H3.12的質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，LipofectamineTM2000和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)用RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)用K-SFM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，均培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，隔天傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C666-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以攜有無意義序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒作為陰性對(duì)照組，以攜有CTA-246H3.12的質(zhì)粒作為CTA-246H3.12組，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，隔天換液。

3.qPCR檢測(cè)：使用Trizol法提取組織或細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)CTA-246H3.12和CDX1 mRNA的表達(dá)，以U6為內(nèi)參檢測(cè)miR-515-5p的表達(dá)。反應(yīng)條件為96℃ 10min、95℃ 10s、62℃ 40s、72℃ 40s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算CTA-246H3.12、miR-515-5p和CDX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。qPCR引物如下：CTA-246H3.12上游引物：5′-CCCAATCACACAGACATTGC-3′，下游引物：5′-TGGGGACCTCATCAACATTT-3′；CDX1上游引物：5′-GGTGGCAGCGGTAAGACTC-3′，下游引物：5′-TGTAACGGCTGTAATGAAACTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGTGGGAGCGAATCGAGG-3′，下游引物：5′-CAGCGCAAGATGTCCATCA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-515-5p上游引物：5′-GGGTTCTCCAAAAGAAAGCAC-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

4.MTT法：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，將兩組細(xì)胞分別以每孔2000個(gè)接種于96孔板，分別在第1、2、3、4、5天進(jìn)行MTT法測(cè)量。每孔加入10μl MTT溶液，在孵箱內(nèi)培養(yǎng)4h，除去孔內(nèi)氣泡，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，每組4個(gè)復(fù)孔。

5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將RPMI 1640培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠以1∶10的比例混合，每個(gè)小室上室加入100μl，置于培養(yǎng)箱中凝固。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，將兩組分別消化，用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)。在上室加入200μl細(xì)胞懸液(2×104個(gè)細(xì)胞)，在下室加入600μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取出上室，固定、染色、計(jì)數(shù)。

6.生物信息學(xué)方法：根據(jù)LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA，根據(jù)miRWalk2.0預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析miRNA的靶向基因。

7.Western blot法檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，將兩組細(xì)胞裂解并提取總蛋白，按50μg蛋白上樣進(jìn)行10%聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉，分別與一抗在4℃下孵育過夜，與二抗孵育后，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。

結(jié) 果

1.CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中的表達(dá)：與慢性鼻咽炎組織比較，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.01，圖1)。

圖1 CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中的表達(dá)

2.CTA-246H3.12在正常鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞系的表達(dá)：與人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)比較，CTA-246H3.12在鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)中表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，C666-1細(xì)胞中CTA-246H3.12的表達(dá)量最低(P<0.01，圖2)。

圖2 CTA-246H3.12在人永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)與NP69細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.CTA-246H3.12質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率：陰性對(duì)照組和CTA-246H3.12組C666-1細(xì)胞中CTA-246H3.12相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.22和11.43±0.96(P<0.01)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

4.上調(diào)CTA-246H3.12對(duì)C666-1細(xì)胞增殖的影響：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，CTA-246H3.12組的C666-1細(xì)胞從第3天起，增殖能力降低(P<0.05，圖3)。

圖3 CTA-246H3.12對(duì)鼻咽癌細(xì)胞C666-1增殖的影響與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.上調(diào)CTA-246H3.12對(duì)C666-1細(xì)胞侵襲的影響：陰性對(duì)照組和CTA-246H3.12組C666-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為81.62±4.59和38.01±7.27(P<0.01，圖4)。與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染CTA-246H3.12后的鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力被抑制。

圖4 CTA-246H3.12對(duì)鼻咽癌細(xì)胞C666-1侵襲的影響

6.生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)結(jié)果：如圖5所示，LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA是miR-515-5p，miRWalk2.0預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析miR-515-5p的靶向基因是CDX1。

圖5 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)CTA-246H3.12的靶基因

7.兩組細(xì)胞中miR-515-5p、CDX1 mRNA的表達(dá)：陰性對(duì)照組和CTA-246H3.12組C666-1細(xì)胞中miR-515-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.12和0.25±0.03(t=6.45，P<0.01)。與陰性對(duì)照組比較，CTA-246H3.12組細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)降低。陰性對(duì)照組和CTA-246H3.12組C666-1細(xì)胞中CDX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.22和7.04±0.81(t=7.08，P<0.01)。與陰性對(duì)照組比較，CTA-246H3.12組細(xì)胞中CDX1 mRNA的表達(dá)增加。

8.上調(diào)CTA-246H3.12對(duì)CDX1蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響：Western blot法結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染CTA-246H3.12后，CDX1蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Twist2、Slug的表達(dá)明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè) CTA-246H3.12對(duì)CDX1蛋白表達(dá)的影響

討 論

尋找新的鼻咽癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)，是臨床鼻咽癌的未來治療的方向[7]。越來越多的研究表明, 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)可發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的作用，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[8]。lncRNA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移行為的影響受到廣泛的關(guān)注[9]。lncRNA如THOR、HOTAIR、LINC00460、C22orf32-1、ANRIL等對(duì)鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移具有重要的調(diào)控作用，與鼻咽癌患者的預(yù)后相關(guān)，可能參與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展[2, 4～6, 10]。CTA-246H3.12是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在疾病特別是鼻咽癌中的分子機(jī)制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，表明CTA-246H3.12可能在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。MTT法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲。近年來研究表明，lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，特異性地與miRNA 結(jié)合，下調(diào)miRNA的活性，從而間接上調(diào)miRNA靶基因的表達(dá)[11, 12]。生物信息學(xué)方法顯示，CTA-246H3.12的靶基因可能是miR-515-5p，miR-515-5p的靶基因可能是尾側(cè)型同源盒轉(zhuǎn)錄因子1(CDX1)。CDX1屬于CDX家族的成員之一，最初被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控胚胎發(fā)育的作用，參與調(diào)控腸上皮細(xì)胞的分化和維持腸上皮結(jié)構(gòu)[13]。近年來研究表明，CDX1在胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)缺失，與腫瘤的增殖、遷移和侵襲行為的獲得呈負(fù)相關(guān)[14, 15]。高表達(dá)CDX1可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，CDX1發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CTA-246H3.12的C666-1細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)降低，CDX1mRNA的表達(dá)增加，下調(diào)miR-515-5p的活性，從而間接上調(diào)miR-515-5p靶基因CDX1的表達(dá)。CDX1表達(dá)表達(dá)上調(diào)后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Twist2、Slug的表達(dá)明顯降低，表明鼻咽癌C666-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低。

綜上所述，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，上調(diào)CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其分子機(jī)制可能是通過抑制miR-515-5p的表達(dá)，間接促進(jìn)CDX1基因的表達(dá)。CTA-246H3.12在鼻咽癌的發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因作用，為今后鼻咽癌的治療提供新的潛在治療靶點(diǎn)。