劉建梅，賈俊亞，閆鐵昆，于亞民，韋麗，商文雅，林珊

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院腎內(nèi)科，天津300052

糖尿病和骨代謝異常之間存在密切聯(lián)系［1］。研究［2-3］顯示，2型糖尿病患者髖骨和脊椎骨骨折的風險增加。糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，占糖尿病患者的40%，是全球終末期腎病（ESRD）的主要病因之一。糖尿病腎病患者存在明顯骨代謝改變，包括骨質(zhì)減少、骨折和骨質(zhì)疏松癥風險增加［4-5］。Klotho是成纖維細胞生長因子-23（FGF23）的輔助受體，主要表達于腎小管上皮細胞，Klotho和FGF23兩者相互作用參與礦物質(zhì)平衡［6］。最近研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，Klotho在成骨細胞/骨細胞中也有表達，并在骨組織—甲狀旁腺激素（PTH）反應(yīng)中起重要作用。研究［9-11］顯示，在糖尿病腎病狀態(tài)下，腎組織及循環(huán)系統(tǒng)中Klotho表達均有明顯減少。以往研究證實PTH可促進成骨細胞分化活性的增加，可使cAMP、p-PKA、p-ERK1/2等細胞內(nèi)分子表達增加［12］。2014年2月—2016年11月，本研究觀察了外源性Klotho對糖尿病腎病小鼠成骨細胞PTH刺激的分化活性的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 小鼠 18周齡KK-Ay糖尿病腎病模型小鼠及C57BL/6J正常小鼠各12只，購自協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心，于SPF實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周，斷尾法測血糖后處死。

1.2 小鼠成骨細胞的培養(yǎng)與鑒定 利用骨片貼壁分離篩選法。處死小鼠后取股骨剪碎，與含有2 mg/mLⅡ型膠原酶和2%青霉素-鏈霉素的α-MEM消化培養(yǎng)基在37℃水浴中溫育4 h，PBS洗滌骨片，并在補充有2%青霉素—鏈霉素和10%小牛血清（PAA）的α的A清（培養(yǎng)基中培養(yǎng)至90%匯合，即可獲得骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSC），其后在磷酸甘油及地塞米松培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化為成骨細胞。采用免疫組化法分析細胞表達堿性磷酸酶（ALP）、骨橋蛋白（OPN）及采用von Kossa染色分析細胞外磷酸鈣沉積及骨結(jié)節(jié)形成等成骨細胞特征性標志物，對成骨細胞進行鑒定。鑒定結(jié)果顯示，細胞中ALP表達顯著增加，von Kossa染色及HE染色顯示骨結(jié)節(jié)形成，證實為成骨細胞。

1.3 細胞分組和PTH（1-34）、Klotho刺激 取第3代培養(yǎng)細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分為A、B組，A組為KK-Ay小鼠成骨細胞，B組為C57BL/6J小鼠成骨細胞。A組成骨細胞分別加入不同濃度的PTH（1-34）、Klotho，其中A1組加入0μg/mL的PTH（1-34），A2組加入0.05μg/mL的PTH（1-34），A3組加入0.1μg/mL的PTH（1-34），A4組加入0.2μg/mL的PTH（1-34），A5組加入0.1μg/mL的PTH（1-34）和100 ng/mL的Klotho。B組成骨細胞參照A組各亞組給予相同刺激，分別記為B1組、B2組、B3組、B4組、B5組。

1.4 各組細胞中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、磷酸化蛋白激酶A（p-PKA）、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）1/2檢測 觀察各組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量，以cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量表示成骨細胞對PTH刺激的反應(yīng)性。

1.4.1 各組細胞中cAMP檢測 采用ELISA法。取各組細胞，裂解、稀釋后加入中和緩沖液及乙?；噭?，震蕩并孵育后轉(zhuǎn)移至96孔板，按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟操作，用酶標儀分析450 nm處吸光度值，并與cAMP標準曲線進行比較，計算細胞中cAMP濃度。

1.4.2 各組細胞中p-PKA、p-ERK1/2檢測 采用蛋白印跡法。取各組細胞，加入200μL含PMSF裂解液，于冰上裂解30 min，將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL EP管中，4℃條件下12 000轉(zhuǎn)離心5 min，收集上清液，加4集蛋白上樣緩沖液，使上樣緩沖液稀釋為1白；將蛋白置于蛋白加熱器上煮10 min，于-80℃冰箱保存。制備BCA標準品，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的標準品孔中，補足到20μL；加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20μL，各孔加入200μL BCA工作液，37℃振蕩孵育30 min，冷卻至室溫；酶標儀測定562 nm處吸光度值，以標準品吸光度值和相應(yīng)蛋白濃度繪制標準曲線，由此標準曲線計算出待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。蛋白變性后上樣，每個上樣孔加入40μg的蛋白進行電泳，將硝酸纖維素膜和濾紙在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30 min，280 mA恒流電轉(zhuǎn)移2 h。將PVDF膜浸于膜封閉液中室溫孵育，2 h后棄去膜封閉液，稀釋并加入一抗，4℃輕搖孵育過夜，棄去一抗溶液，TBST溶液室溫下?lián)u洗5次，每次1 min。棄去TBST，加入適量稀釋的二抗，室溫輕搖孵育1 h，TBST溶液室溫下?lián)u洗5次，每次1 min，置于Chemi Genus2凝膠成像分析系統(tǒng)中進行曝光和攝像，使用Quantity One Software 4.6.2軟件進行條帶灰度值測算，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的條帶灰度值/同一樣本GAPDH灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

A1組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.1±0.0）nmol/mL、0.2±0.0、0.3±0.1，A2組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.2±0.0，A3組細 胞 中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.3±0.1，A4組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.2±0.0，組間相比，P均>0.05，提示KK-Ay小鼠成骨細胞對PTH（1-34）刺激無反應(yīng)。

B1組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.2±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.5±0.1，B2組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.4±0.1）nmol/mL、1.2±0.4、1.9±1.0，B3組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.6±0.1）nmol/mL、2.3±0.8、3.3±1.5，B4組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.8±0.1）nmol/mL、3.6±1.5、5.3±2.8，組間相比，P均<0.05，提示C57BL/6J小鼠成骨細胞對PTH（1-34）的刺激反應(yīng)性與PTH（1-34）的濃度有關(guān)，呈劑量依賴性上升。

A5組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.6±0.1）nmol/mL、4.7±2.2、5.5±1.8，B5組細胞中cAMP濃度、p-PKA相對表達量、p-ERK1/2相對表達量分別為（0.6±0.2）nmol/mL、3.7±1.8、5.6±2.3，兩組相比，P均>0.05，說明加入外源性Klotho后，兩組小鼠成骨細胞對PTH（1-34）的刺激反應(yīng)性一致。

3 討論

糖尿病腎病常導(dǎo)致骨代謝異常，常表現(xiàn)為明顯的低動力性骨病，加重慢性腎臟病相關(guān)的鈣磷代謝紊亂，如何糾正糖尿病腎病狀態(tài)下成骨細胞活性的下降，是重要的臨床課題［13］。最近發(fā)現(xiàn)，Klotho在成骨細胞-甲狀旁腺激素反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用［7-8］，在糖尿病腎病患者，循環(huán)系統(tǒng)中Klotho表達明顯減少［9-11］。本研究探討了外源性重組Klotho對體外原代培養(yǎng)KK-Ay小鼠的成骨細胞PTH（1-34）信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)在外源性重組Klotho作用下，成骨細胞中cAMP、p-PKA及p-ERK1/2水平顯著上升，提示Klotho可恢復(fù)PTH對糖尿病腎病成骨細胞活性的促進作用，可能有利于糾正低轉(zhuǎn)化骨病狀態(tài)。

cAMP是細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)最為常見的第二信使，參與調(diào)節(jié)成骨細胞的分化，并通過激活cAMP依賴性蛋白激酶A（PKA）發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14-15］。ERK1/2是MAPK家族的一員，具有酶促級聯(lián)反應(yīng)特點，在細胞信號傳導(dǎo)通路中，ERK1/2可通過調(diào)節(jié)成骨細胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子Osterix促進成骨細胞分化［15］。在本研究中，我們選用觀察cAMP、PKA和ERK1/2作為反映成骨細胞生物活性的對象。PTH可通過其受體PTH1R激活腺苷酸環(huán)化酶，促進cAMP生成，進一步激活PKA調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與成骨細胞的生長分化。我們采用外源性重組PTH（1-34）刺激體外培養(yǎng)的成骨細胞，在C57BL/6J小鼠原代成骨細胞中，cAMP、p-PKA、p-ERK1/2的水平明顯升高，并呈劑量依賴性，說明外源性PTH（1-34）刺激成骨細胞，通過cAMP-PKA通路和ERK-MAPK通路促進了其生長分化。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6J小鼠不同，在KK-Ay小鼠體外培養(yǎng)的成骨細胞中，補充外源性重組PTH（1-34）未見cAMP、p-PKA、p-ERK1/2的水平明顯上升，提示糖尿病腎病狀態(tài)下存在抑制PTH效應(yīng)的因素。研究［16］已經(jīng)證實，Klotho是促進成骨細胞ERK1/2激活的重要因子，我們在KK-Ay小鼠體外培養(yǎng)的成骨細胞中加入外源性重組Klotho后證實，cAMP、p-PKA、ERK1/2水平明顯上升。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)KK-Ay糖尿病腎病小鼠骨組織Klotho表達明顯下降。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認為，在糖尿病腎病狀態(tài)下骨組織中Klotho表達下降，單純PTH刺激不能有效誘導(dǎo)成骨細胞增生分化，而在補充Klotho后，成骨細胞對PTH刺激恢復(fù)了反應(yīng)，說明Klotho在PTH-成骨細胞反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，正常小鼠成骨細胞對PTH刺激反應(yīng)性呈劑量依賴性上升，而糖尿病腎病小鼠成骨細胞對PTH刺激無反應(yīng)；加入外源性Klotho可促進糖尿病腎病小鼠成骨細胞對PTH的刺激反應(yīng)，這為我們進一步研究糖尿病腎病骨代謝異常的發(fā)生機制提供了重要的線索，也為干預(yù)糖尿病腎病低轉(zhuǎn)化骨病提出了新的靶點。