伍柳玉，胡艷玲，劉順，秦小玲，梁秋麗，劉美良，楊鈺，曾小云

1廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧530199；2廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)公共與管理學(xué)院

研究［1-2］顯示，乙酰輔酶A羧化酶（ACACB）作為參與體內(nèi)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝等過(guò)程的關(guān)鍵基因，被發(fā)現(xiàn)在癌癥中也發(fā)揮重要作用。已有研究［3-4］顯示，ACACB基因在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。DNA甲基化作為表觀遺傳的一種，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。研究［5-6］表明，在各腫瘤細(xì)胞中普遍存在DNA的異常甲基化，其存在導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)的沉默或上調(diào)，造成包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡或控制關(guān)鍵的腫瘤相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路的改變，影響腫瘤的診斷、發(fā)展、分型以及治療敏感性［7-8］。本課題組前期通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ACACB基因進(jìn)行生物信息學(xué)整合時(shí)發(fā)現(xiàn)，ACACB在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與其甲基化位點(diǎn)cg06131338的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，據(jù)此推測(cè)ACACB基因可能具有影響肝癌發(fā)生發(fā)展的作用，但進(jìn)一步的研究論證尚未在肝癌細(xì)胞株中開展。2018年10月—2020年1月，本研究觀察了抑制ACACB基因DNA甲基化/感染ACACB基因過(guò)表達(dá)慢病毒dCAS9-VP64的肝癌細(xì)胞株MHCC97H增殖侵襲遷移能力變化情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑 肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及正常肝細(xì)胞株LO2均購(gòu)買于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代及細(xì)胞提取。胎牛血清、DMEM/MEM/RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS緩沖液、二甲基亞砜(DMSO）購(gòu)自北京索萊寶公司，氯仿購(gòu)自北京天根公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Life公司，Thermo Scientific Gene-JET基因組DNA純化試劑盒購(gòu)自Thermo公司，DNA maker購(gòu)自北京天根公司，CCK8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自Ta-KaRa公司，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-CdR）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，引物由生工生物公司合成，ACACB過(guò)表達(dá)慢病毒dCAS9-VP64購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。

1.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA檢測(cè) 取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2細(xì)胞于培養(yǎng)板中，使用Thermo Scientific GeneJET基因組DNA純化試劑盒提取總DNA，使用TRIzol試劑裂解細(xì)胞并提取RNA，使用Bio-teck酶標(biāo)儀進(jìn)行濃度及純度的檢測(cè)。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ACACB上游引物為5′-GGGAAAGCAAAATGAATGGAAG-3′，下游引物為5′-GAGAAGAGGTGGGCAGAGGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物為5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR擴(kuò)增體系共20μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ10μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye 0.4μL，上下游引物各0.8μL，dH2O 6μL。PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中ACACB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2細(xì)胞中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率測(cè)算及受試肝癌細(xì)胞株篩選 采用焦磷酸測(cè)序?qū)嶒?yàn)，取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2細(xì)胞于培養(yǎng)板中，使用Thermo Scientific Gene-JET基因組DNA純化試劑盒提取總DNA，使用Bioteck酶標(biāo)儀進(jìn)行濃度及純度的檢測(cè)。重亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化按照EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit 59124試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，配置的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化體系為140μL：DNA溶液40μL，亞硫酸氫鹽混合液85μL，DNA Protect Buffer 15μL，RNase-free water補(bǔ)充至總體積140μL，熱循環(huán)條件：95℃5 min，60℃25 min，95℃5 min，60℃85 min，95℃5 min，60℃175 min。ACACB基因cg06131338位點(diǎn)的上游引物為F-TGGAGTTATATATAGGGTGGATTTTAGAAG，下 游 引物為R-CAATCCCCATAAACTCTATACTATTTCTTC。甲基化PCR反應(yīng) 體系：dH2O 34.8μL，5×buffer 10μL，dNTP 1μL，上下游引物各1μL，Template 2μL，Taq 0.2μL。反應(yīng)條件：95℃3 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，72℃7 min，40個(gè)循環(huán)。甲基化的檢測(cè)通過(guò)Pyrosequencing檢測(cè)儀進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后使用PyroMark Q96 ID軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率。

1.4 受試肝癌細(xì)胞株ACACB基因DNA甲基化的抑制及分組 選取甲基化率相對(duì)較高的肝癌細(xì)胞株MHCC97H，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至3.5×104/mL，按每孔2 mL的體積接種于6孔板中，正常培養(yǎng)16～24 h后分為5-Aza-CdR組、對(duì)照組。5-Aza-CdR組每孔加入2 mL濃度為2.5μmol/L的5-Aza-CdR完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含相同劑量DMSO完全培養(yǎng)基，每隔24 h更換一次完全培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞，參照“1.3”測(cè)算5-Aza-CdR組、對(duì)照組細(xì)胞中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率，參照“1.2”檢測(cè)5-Aza-CdR組、對(duì)照組細(xì)胞中ACACB mRNA。

1.5 受試肝癌細(xì)胞株ACACB基因過(guò)表達(dá)慢病毒dCAS9-VP64感染及分組 采用SAM雙載體慢病毒感染法。選取甲基化率相對(duì)較高的肝癌細(xì)胞株，取8×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)16～24 h后，感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒并繼續(xù)培養(yǎng)12 h，更換為正常培養(yǎng)基，3 d后改用2.5μmol/L嘌呤霉素濃度的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。收集成功感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒的細(xì)胞分為ACACB過(guò)表達(dá)組和陰性表達(dá)組，按照上述步驟感染dCAS9-VP64慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒，參照“1.2”檢測(cè)ACACB過(guò)表達(dá)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞中ACACB mRNA。

1.6 各組細(xì)胞增殖能力觀察 取各組細(xì)胞以1 000/孔的量接種于96孔板中，每組重復(fù)6個(gè)平行復(fù)孔，培養(yǎng)8 h待細(xì)胞貼壁后，將完全培養(yǎng)基與CCK8試劑按9∶1的比例混合，以100μL/孔的混合液加入后，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h，在450 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀讀取每孔的OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。

1.7 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力觀察 ①各組細(xì)胞侵襲能力觀察。取各組細(xì)胞，以1×105個(gè)加入含有基質(zhì)膠的侵襲小室的上層，小室下層加入650μL的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜細(xì)胞，用0.1%的結(jié)晶紫染色、干燥，各侵襲小室在顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞增殖能力。②細(xì)胞遷移能力觀察。取各組細(xì)胞，以5×104個(gè)加入不含基質(zhì)膠的遷移小室的上層，小室下層加入650μL的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜細(xì)胞，用0.1%的結(jié)晶紫染色、干燥，顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以遷移細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.54±0.04、0.48±0.05、0.39±0.03、0.34±0.01，LO2中ACACB mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.04±0.07，SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相對(duì)表達(dá)量與LO2相比，P均<0.01。

2.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2細(xì)胞中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率比較及受試肝癌細(xì)胞株篩選結(jié)果 肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率分別為54.68%±3.63%、62.43%±3.77%、66.29%±2.29%、62.25%±3.28%，正常肝細(xì)胞株LO2中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率為44.29%±3.69%，肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率與正常肝細(xì)胞株LO2相比，P均<0.01。其中，cg06131338位點(diǎn)甲基化率相對(duì)較高的肝癌細(xì)胞株為MHCC97H，選取MHCC97H為后續(xù)實(shí)驗(yàn)受試肝癌細(xì)胞株。

2.3 5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率、ACACB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞中ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率分別為45.59%±2.51%、67.55%±3.18%，兩組相比，P<0.01。5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞中ACACB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.03、0.39±0.03，兩組相比，P<0.01。

2.4 ACACB過(guò)表達(dá)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞中ACACB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 ACACB過(guò)表達(dá)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞中ACACB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為5.90±0.65、1.04±0.05，兩組相比，P<0.01。

2.5 各組細(xì)胞增殖能力比較 5-Aza-CdR組和對(duì)照組細(xì)胞孵育72 h時(shí)的OD值分別為0.42±0.01、0.58±0.01，兩組相比，P<0.05。ACACB過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞孵育72 h時(shí)的OD值分別為0.37±0.04、0.45±0.05，兩組相比，P<0.05。

2.6 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 5-Aza-CdR組和對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（12±4）、（43±3）個(gè)，兩組相比，P<0.01。ACACB過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（17±5）、（47±7）個(gè)，兩組相比，P<0.01。5-Aza-CdR組和對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（21±4）、（63±6）個(gè)，兩組相比，P<0.01。ACACB過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（17±6）、（49±14）個(gè)，兩組相比，P<0.01。

3 討論

HCC是全球范圍內(nèi)最常見的幾大癌癥之一。研究［9］顯示，HCC是一種復(fù)雜的、多步驟的疾病，涉及的過(guò)程與基因組的擴(kuò)增、缺失或突變有關(guān)。同時(shí)，由于HCC起病隱匿、病死率高［10］，因此尋找高靈敏度與高特異度的肝癌早期診斷分子生物標(biāo)記物仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

ACACB基因是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶［11］，可能參與多種腫瘤的形成與發(fā)展，其表達(dá)能對(duì)相關(guān)癌癥的走向產(chǎn)生影響。早期針對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的研究［12］顯示，ACACB基因可能通過(guò)參與有關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控，如脂質(zhì)的代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡等，從而在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。還有研究［13］發(fā)現(xiàn)，ACACB基因與肺癌患者的生存率顯著相關(guān)，并且在人肺癌樣本中表達(dá)普遍下調(diào)，且通過(guò)建立小鼠基因敲除模型，驗(yàn)證了ACACB基因的敲除能顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)肺腫瘤的發(fā)生。本研究通過(guò)LO2肝細(xì)胞株與4株肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97的培養(yǎng)與檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了ACACB基因在肝癌細(xì)胞株中表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步，我們通過(guò)在MHCC97H細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)ACACB基因后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移的能力均下降，故推測(cè)ACACB基因在HCC的惡性化進(jìn)展中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。相關(guān)體內(nèi)研究［13-14］亦顯示ACACB基因在腫瘤抑制中的作用，這與本研究結(jié)果具有一致性。

DNA甲基化作為最常見的一種表觀遺傳方式，對(duì)細(xì)胞的分化與功能起著至關(guān)重要的作用［15］。隨著基因組學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)、基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生三者之間密切相關(guān)。研究［5-6］表明，當(dāng)基因組特定序列出現(xiàn)異常的高/低甲基化時(shí)，往往能導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)的改變，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。QI等［16］通過(guò)大樣本人群驗(yàn)證了MGMT基因的超甲基化與大腸癌中MGMT表達(dá)的缺失有關(guān)，認(rèn)為MGMT基因表觀遺傳失活加快了大腸癌的進(jìn)程。SIZEMORE等［17］通過(guò)建立乳腺癌患者隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，基因MMP7的表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)顯著相關(guān)。不僅如此，由于異常甲基化的發(fā)生通常要先于細(xì)胞的惡性增生，故而DNA的局部異常甲基化對(duì)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)及早期癌癥篩查方面具有重要參考作用［18］。本研究中，通過(guò)檢測(cè)ACACB基因cg06131338位點(diǎn)在LO2肝細(xì)胞株與肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)了cg06131338位點(diǎn)在各肝癌細(xì)胞株中甲基化率顯著增加，且可能與基因表達(dá)的抑制有關(guān)。為進(jìn)一步探索，我們利用DNA甲基化可逆的特點(diǎn)，使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR作用于MHCC97H細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在cg06131338位點(diǎn)的甲基化水平降低的同時(shí)，ACACB的轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)升高。隨后，本研究通過(guò)細(xì)胞相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR的處理能顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移的能力。本研究結(jié)果表明，cg06131338位點(diǎn)的高甲基化可能通過(guò)抑制基因ACACB的表達(dá)，并由此促進(jìn)HCC的進(jìn)展。

綜上，在肝癌細(xì)胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中，ACACB mRNA表達(dá)降低、ACACB基因cg06131338位點(diǎn)甲基化率升高，抑制cg06131338位點(diǎn)的甲基化可升高ACACB mRNA表達(dá)水平。抑制cg06131338位點(diǎn)的甲基化或過(guò)表達(dá)ACACB均可降低MHCC97H細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。ACACB基因可能是HCC中潛在的抑癌基因，ACACB基因及其甲基化位點(diǎn)cg06131338可能是潛在的肝癌早期診斷標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)。