田 瑜，劉志光，付 皓

(河南省安陽生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，河南 安陽 455000)

1 引言

隨著科技的飛速發(fā)展，環(huán)境檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展。生態(tài)環(huán)境部不斷更新環(huán)境檢測方法，環(huán)境檢測機構(gòu)為提高業(yè)務(wù)能力和擴大業(yè)務(wù)范圍不斷引入新的標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。檢測機構(gòu)在使用標(biāo)準(zhǔn)方法或非標(biāo)準(zhǔn)方法時，應(yīng)先對其進行方法驗證或確認[1，2]。生態(tài)環(huán)境部和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布了一系列的標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)分析實驗室開展方法驗證或確認[3～5]。盡管如此，實驗室在進行方法驗證和確認時仍面臨不少問題。本文主要探討實驗室如何開展方法驗證和確認。

2 方法驗證和確認的意義

實驗室進行方法驗證或確認目的是為了提供客觀證據(jù)證明并保證實驗室操作滿足標(biāo)準(zhǔn)方法或非標(biāo)準(zhǔn)方法的要求，以及該標(biāo)準(zhǔn)方法或非標(biāo)準(zhǔn)方法可以滿足實驗室分析項目檢測的需求。

3 方法驗證和方法確認性能指標(biāo)的選擇

實驗室在引入新標(biāo)準(zhǔn)方法時，首先要證明本實驗室現(xiàn)有的設(shè)施設(shè)備、人員及技術(shù)能力、環(huán)境條件、試劑材料、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等條件滿足該標(biāo)準(zhǔn)方法要求，能夠獲得準(zhǔn)確，可信、有效的檢測結(jié)果。對標(biāo)準(zhǔn)方法性能指標(biāo)的驗證包括但不限于：校準(zhǔn)曲線、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、空白試驗、測定上限、測定下限等。

非標(biāo)準(zhǔn)方法在標(biāo)準(zhǔn)方法性能指標(biāo)進行確認的基礎(chǔ)上，增加了對方法的適用范圍、干擾因素及消除方法等因素進行確認。 因此方法驗證或確認的性能指標(biāo)可根據(jù)實驗室現(xiàn)有的技術(shù)條件、經(jīng)濟條件來確定，至少包括表1中選擇的方法性能指標(biāo)。

此外對于不確定度的測量，可根據(jù)實驗室及相關(guān)需求確定是否需要測量不確定度。

4 方法性能指標(biāo)驗證和確認

4.1 檢出限

經(jīng)常被混淆的檢出限概念是儀器檢出限和方法檢出限。儀器檢出限是不考慮樣品制備和前處理過程的影響，是儀器能夠定性檢測出待測物質(zhì)的最低濃度或最小量,是區(qū)別于背景信號，儀器檢測的最小可靠信號。通常用信噪比(S/N)表示，當(dāng)(S/N)≥3時，定義為儀器檢出限。由此可以看出儀器檢出限與儀器的性能有關(guān)，用來衡量儀器是否滿足實驗要求。

方法檢出限需要按照特定的分析方法的全部處理步驟處理樣品和分析測定樣品，在給定置信度內(nèi)區(qū)別于空白試樣的被檢測出的最低濃度或最小量。由此可以看出儀器檢出限要比方法檢出限低。兩者的區(qū)別在于是否考慮樣品制備及前處理的影響。

確定方法檢出限的意義在于，當(dāng)待測物的濃度趨近于零時，該方法能否檢出該物質(zhì)。方法檢出限的具體確定步驟及計算如下。

空白實驗中檢出目標(biāo)物質(zhì)。按照樣品分析的全步驟，重復(fù)n≥7次空白試驗。將各次結(jié)果換算為樣品中的濃度或含量，計算n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照公式(1)計算檢出限:

MDL=t(n-1,0.99)×S

(1)

式(1)中： t表示自由度為n-1，置信度為99%時t分布的單邊臨界值(單邊t值)，可查有關(guān)的單邊t值分布表獲得；S表示n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

如果空白試樣中無目標(biāo)物可加適量的目標(biāo)物后，以空白加標(biāo)的樣品來測定。但是要滿足：任意測定值之間可允許的偏差范圍空白試驗測定值的均值±1/2檢出限。

通常關(guān)于水體的方法檢出限按照上述確定即可，但是涉及土壤、沉積物、固體廢物的檢出限，實驗室常常會面臨該如何計算方法檢出限。涉及土壤、沉積物或固體廢物中的監(jiān)測項目檢出限的確定方法，一種是以實驗用水加入適量的目標(biāo)物質(zhì)做空白實驗，按照方法要求的前處理處理及測定后，再按照公式(1)計算出液態(tài)時檢出限，然后轉(zhuǎn)換成方法要求相應(yīng)稱樣量、定容體積條件下的檢出限。另一種對于土壤中重金屬項目檢出限用硅藻土做空白實驗，測定土壤中監(jiān)測項目的檢出限；對于土壤中有機物項目采用石英砂做空白實驗。

對于分光光度法，檢出限以扣除空白值后與0.01吸光度相對應(yīng)的濃度值為方法檢出限。對于滴定分析中，一般以滴定管最小液滴體積計算，通常為以消耗0.02mL標(biāo)準(zhǔn)溶液所對應(yīng)的濃度或者含量作為方法檢出限。

計算出檢出限后，實驗室要對檢出限進行評估，當(dāng)實驗室測定的檢出限值小于或等于方法所規(guī)定的檢出限時，說明該方法檢出限滿足要求。當(dāng)實驗室測定的檢出限高于標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的檢出限時，說明實驗空白值不合格，存在干擾因素或試劑不合格。應(yīng)找出原因，消除干擾后，重新測定直至小于等于方法規(guī)定檢出限。

4.2 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度常用于度量一個特定分析程序所獲得的分析結(jié)果(單次測定值或重復(fù)測定值的均值)與假定的或公認的真值之間的符合程度。一個分析方法或分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確度是反應(yīng)該方法或該測量系統(tǒng)存在的系統(tǒng)誤差和隨機誤差的綜合指標(biāo)，它決定著這個分析結(jié)果的可靠性。

對于分析方法的準(zhǔn)確度，可采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量法或以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做回收率測定的方法評價分析方法和測量系統(tǒng)的準(zhǔn)確度。

(1)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量法判定準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度用絕對誤差或相對誤差來表示。通常以重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以測量值的平均值與真值的偏差做比較，測定結(jié)果要在置信區(qū)間內(nèi)。

(2)用加標(biāo)回收率測定法判定準(zhǔn)確度。在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定其回收率。回收率計算公式如下：

(2)

加標(biāo)回收實驗應(yīng)注意幾點：加標(biāo)物的形態(tài)應(yīng)該和待測物的形態(tài)相同；加標(biāo)量應(yīng)盡量與樣品中待測物含量相等或相近，并應(yīng)注意對樣品容積的影響；當(dāng)樣品中待測物含量接近方法檢出限時，加標(biāo)量應(yīng)控制在校準(zhǔn)曲線的低濃度范圍；當(dāng)樣品中待測物濃度高于校準(zhǔn)曲線的中間點時，加標(biāo)量應(yīng)控制在待測物濃度的半量；在任何情況下加標(biāo)量均不得大于待測物含量的3倍；加標(biāo)后的測定值不應(yīng)超出方法的測量上限的90%[6]。

4.3 精密度

精密度是使用特定的分析程序在受控條件下重復(fù)分析同一樣品所得測定值之間的一致程度。它反映了分析方法或測量系統(tǒng)存在的隨機誤差的大小。精密度通常用極差、平均偏差和相對平均偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。標(biāo)準(zhǔn)偏差在數(shù)理統(tǒng)計中屬于無偏估計量而常被采用。精密度中包含重復(fù)性和再現(xiàn)性。在進行方法驗證或確認時，盡可能覆蓋到重復(fù)性和再現(xiàn)性。特別是再現(xiàn)性應(yīng)盡可能地涵蓋包括人員、環(huán)境、試劑、設(shè)施設(shè)備、技術(shù)能力、其他可能存在的不可控因素等的影響。

由于分析結(jié)果的精密度與待測物質(zhì)的濃度水平及實驗條件有關(guān)，通常所做的精密度測試結(jié)果分別選用測量范圍內(nèi)的低濃度，中等濃度和高濃度三種梯度的濃度樣品進行測定。此外由于標(biāo)準(zhǔn)偏差受次數(shù)的影響，因此最少測定6次。

4.4 校準(zhǔn)曲線

校準(zhǔn)曲線至少有6個濃度點(包括校準(zhǔn)零點)。其濃度范圍應(yīng)覆蓋待測物質(zhì)的主要分布范圍。最低濃度點一般選在定量限附近，中間點盡量為待測物質(zhì)平均濃度范圍。每個濃度點最少測量兩次。相關(guān)系數(shù)應(yīng)符合相應(yīng)的要求。

此外繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意：應(yīng)在分析樣品的同時繪制工作曲線，并要達到質(zhì)量要求；校準(zhǔn)曲線不能相互借用；應(yīng)使用校準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)的直線部分，不得將校準(zhǔn)曲線在高濃度端外推或在低濃度端順延使用。

4.5 適用范圍

適用范圍指方法適用的環(huán)境監(jiān)測要素和監(jiān)測項目。如方法適用環(huán)境要素是降雨、廢水、土壤、沉積物、固體廢物和環(huán)境空氣等。監(jiān)測項目如：鋅、鎳、氨氮、空氣中的VOCS、降塵等。

對于非標(biāo)準(zhǔn)方法的確認要說明適用環(huán)境要素、監(jiān)測項目、適用濃度范圍。必要時還需確認不適用的范圍。

4.6 實際樣品分析

實驗室開展方法驗證或確認應(yīng)包括對實際樣品的分析檢測，目的是檢驗該方法在實際樣品中的應(yīng)用，并且發(fā)現(xiàn)在實際樣品分析中可能出現(xiàn)的干擾因素，同時針對實際樣品可能出現(xiàn)的干擾因素，進行干擾因素消除實驗。以確保所驗證的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于實際樣品的分析。

4.7 干擾因素及消除

對于非標(biāo)準(zhǔn)方法的確認，必須進行干擾因素及消除實驗，以便更好適用實驗室檢測需求。一般要對試劑基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)、不含或含待測物質(zhì)接近零的樣品基質(zhì)進行干擾因素測定，以及在上述基質(zhì)中加入可能的干擾因子進行測定，并采取有效措施，消除干擾。針對可能存在的共存物質(zhì)，要做干擾實驗，檢驗其是否存在干擾，采取措施消除干擾，并了解共存物質(zhì)最大允許濃度。干擾實驗選擇兩個或多個待測物質(zhì)濃度和不同濃度水平的共存物進行實驗測定。

常見的消除干擾的方法有加入基體改進劑、消電離劑、保護劑、掩蔽劑、化學(xué)預(yù)分離等，標(biāo)準(zhǔn)加入法在一定程度上也能消除干擾。

5 異常值判斷

在進行方法驗證或確認時，出現(xiàn)異常值是常見的問題，但是如何判斷一組數(shù)據(jù)中是某個或某幾個數(shù)據(jù)是否是異常值，常常令人疑惑。在環(huán)境檢測中判斷異常值[7]的方法常用的有Grubbs檢驗法、Dixon檢驗法、Cochran檢驗法、偏峰度法等。本文主要介紹Grubbs檢驗法和Dixon檢驗法[7]。

Grubbs檢驗法用于一組測量值的一致性和剔除一組測量值中異常值，該檢驗法一次只能檢出一個異常值。具體計算公式見公式4。

(3)

(4)

由公式(4)計算得出第i個數(shù)(Xi)的Gi值，通過查表得到在規(guī)定檢驗水平α所對應(yīng)的G值，一般指定檢驗水平α為5%、1%或10%。如果Gi值小于該G值則說明Xi不是異常值，否則Xi屬于異常值，應(yīng)該剔除。

Dixon檢驗法用于一組測定值的一致性檢驗和剔除一組測定值中的異常值，該檢驗方法可用于檢出一個或多個異常值。

首先將一組數(shù)據(jù)按大小順序排列：X1

(5)

(6)

通過查表得到在規(guī)定檢驗水平α所對應(yīng)的D值，當(dāng)計算得到的高端異常值小于查表所得的D值時，則無異常值，否則Xn為異常值；計算所得低端異常值小于查表所得的D值時，則無異常值，否則X1為異常值。

當(dāng)出現(xiàn)異常值時，要重視異常值給出的信息，判斷是否存在系統(tǒng)偏差，及時找出原因，排除干擾。

6 結(jié)論

進行標(biāo)準(zhǔn)方法驗證和非標(biāo)準(zhǔn)方法的確認是環(huán)境檢測工作的重要內(nèi)容之一,是保證環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)質(zhì)量的第一步，同時也是實驗室取得資質(zhì)的重要組成。只有經(jīng)過驗證的標(biāo)準(zhǔn)方法或確認的非標(biāo)準(zhǔn)方法才能確定滿足實驗室檢測需求，保障實驗室技術(shù)能力；才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、有效性及科學(xué)性。