苗竹林, 鐘興明, 崔蓉, 李佩佩, 王永霞, 鐘文瑤, 趙文忠

廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院、廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣東廣州 510600)

流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)對(duì)免疫細(xì)胞可進(jìn)行有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，是目前臨床檢驗(yàn)的重要手段。Th1/Th2細(xì)胞及其產(chǎn)生細(xì)胞因子與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]，但目前沒(méi)有廣泛用于臨床，其原因之一為一些醫(yī)院需要外送，標(biāo)本檢測(cè)的及時(shí)性可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的影響，上述問(wèn)題一直困擾著臨床和檢驗(yàn)工作者。流式細(xì)胞技術(shù)分析標(biāo)本的運(yùn)送與保存是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)分析前質(zhì)量控制的重要內(nèi)容，特別是對(duì)一些淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè)，此類(lèi)檢測(cè)項(xiàng)目步驟繁瑣，影響因素多，對(duì)標(biāo)本采集、運(yùn)送、檢測(cè)時(shí)間等都有特別要求，需要注意質(zhì)量控制。而刺激法檢測(cè)細(xì)胞因子，要求在細(xì)胞存活時(shí)間內(nèi)進(jìn)行刺激檢測(cè)，因此，有必要對(duì)標(biāo)本不同存放時(shí)間及溫度對(duì)檢測(cè)外周血胞內(nèi)細(xì)胞因子Th1/Th2檢驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2019年6月期間在我院門(mén)診孕前檢查與正常體檢女性，無(wú)內(nèi)分泌功能紊亂，無(wú)自身免疫性及其他免疫功能紊亂性疾病，隨機(jī)選取20例,年齡21～40歲，平均31歲。

1.2 Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)所用試劑及檢測(cè)步驟 分別在抽血當(dāng)天(第1天)、第2天、第3天進(jìn)行流式細(xì)胞檢驗(yàn)。流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson公司生產(chǎn)，型號(hào)FACS Calibur，熒光單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司，佛波酯 (Phorbolmyfismteacetate，PMA)，離子霉素(ionomycin，Ion)，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻滯劑(Brefeldin A，BFA)、裂解液及破膜劑購(gòu)自(Beyotime公司) ；RPMI1640(GIBCO公司)，上述試劑均4℃避光保存。對(duì)外周血標(biāo)本搖勻后分為兩管，一管室溫放置，另外一管4℃冰箱放置。(1)全血標(biāo)本：取150 μL全血標(biāo)本于試管中，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS) 1∶1等體積稀釋?zhuān)?2)加入8 μL 1 μg/mL PMA工作液+8 μL 50 μg/mL Ionomycin工作液+8 μL 0.5 mg/mL BFA工作液，混勻； (3)細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱3～4 h(不能超過(guò)6 h)；(4)從培養(yǎng)箱取出混勻，加入10 μL CD3 PerCP和2 μL CD8 APC，室溫，避光孵育15 min；(5)每管中加入1 mL溶血素，室溫，避光孵育15 min后加入2 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄除上清；(6)每管中加入破膜劑1 mL，搖勻，室溫避光放置5 min；(7)每管中加入2 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄除上清；(8)各管中加入相應(yīng)的γ干擾素(IFN-γ)/白細(xì)胞介素(IL)-4抗體7～10 μL(A1：同型對(duì)照；A2：IFN-g FITC/IL-4 PE)；(9)室溫，避光孵育20 min。每管中加入2 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄除上清；(10)0.35 mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)過(guò)PMA+Ion刺激后，Th1/Th2細(xì)胞流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激之后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中首先以物理參數(shù)區(qū)分淋巴細(xì)胞群并設(shè)門(mén)，進(jìn)一步收集CD4+/IFN-γ+為T(mén)h1細(xì)胞，CD4+/IL-4+為T(mén)h2細(xì)胞，進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1。

2.2 常溫及4℃冰箱放置下標(biāo)本不同保存時(shí)間Th1、Th2值變化比較 結(jié)果顯示在室溫放置標(biāo)本，抽血后前3 d檢驗(yàn)結(jié)果 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 d后，細(xì)胞因子表達(dá)量急劇減少，與抽血當(dāng)天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在4℃冰箱放置標(biāo)本，抽血后前3 d之內(nèi)檢驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 d后，細(xì)胞因子表達(dá)量急劇減少，與抽血當(dāng)天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。而不同溫度保存，在同一時(shí)間檢測(cè) 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Th1(CD4+/IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+/IL-4+)流式細(xì)胞圖

表1 不同溫度及不同保存時(shí)間對(duì)Th1、Th2變化比較

3 討論

3.2 流式細(xì)胞采用刺激法檢測(cè)Th1、Th2及Th1/Th2機(jī)制及方法 由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激而合成、分泌的細(xì)胞因子是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合進(jìn)一步調(diào)控免疫反應(yīng)。檢測(cè)細(xì)胞因子可以間接反映免疫細(xì)胞的功能及活動(dòng)狀態(tài)[6]。Th2細(xì)胞分化主要的經(jīng)典信號(hào)通路是由白細(xì)胞介素-4(IL-4)來(lái)起始的，IL-4 主要由活化的Th2 細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可以促進(jìn) T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及肥大細(xì)胞的活化增殖，增加巨噬細(xì)胞的殺傷功能， IL-4 可抑制促炎細(xì)胞因子，拮抗其他促炎過(guò)程， 抑制新生血管形成，減少免疫過(guò)程引起的細(xì)胞損傷[7]。IFN-γ 主要來(lái)源于T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，是 Th1 細(xì)胞因子反應(yīng)的經(jīng)典組成部分，能活化產(chǎn)生分泌炎癥細(xì)胞因子的 M1型巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞[8]。因此，同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4，可區(qū)分Th1細(xì)胞(CD4+/IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+/IL-4+)[9]。

因?yàn)殪o止的淋巴細(xì)胞和記憶T細(xì)胞所產(chǎn)生的特異性的免疫應(yīng)答僅分泌少量細(xì)胞因子，因此，必須采用T細(xì)胞活化刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，以利于提高流式細(xì)胞檢測(cè)率，之后進(jìn)行全血孵育、高爾基轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的固定，細(xì)胞裂解，破膜后抗體標(biāo)記，才能夠通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)并進(jìn)行分析[10]。

近年來(lái)，淋巴細(xì)胞檢測(cè)的價(jià)值引起臨床醫(yī)生的重視，開(kāi)展此項(xiàng)目的醫(yī)院也越來(lái)越多，而多數(shù)實(shí)驗(yàn)室人員專(zhuān)注于分析階段的質(zhì)量保證，而分析前階段的質(zhì)量環(huán)節(jié)還存在許多問(wèn)題，上機(jī)檢測(cè)的頻率，標(biāo)本存放的溫度以及時(shí)間等對(duì)Th1與Th2都有一定的影響。

3.3 流式細(xì)胞檢測(cè)Th1、Th2影響因素分析 患者標(biāo)本采集、保存等分析前檢驗(yàn)標(biāo)本質(zhì)量是目前影響流式細(xì)胞檢驗(yàn)質(zhì)量以及檢驗(yàn)結(jié)果的最大不確定因素。流式細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)樣本的保存及上機(jī)時(shí)間都較為嚴(yán)格，進(jìn)行流式細(xì)胞檢驗(yàn)的標(biāo)本，無(wú)論哪一種抗凝劑，一般都可以在室溫(16～25℃)保存，但是不同的檢驗(yàn)項(xiàng)目保存的時(shí)間長(zhǎng)短是不同的。檢驗(yàn)樣本要新鮮采集，不能發(fā)生凝血。樣本最好應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理，并進(jìn)行免疫熒光染色和固定，標(biāo)記好細(xì)胞后使用標(biāo)準(zhǔn)溶血?jiǎng)┦辜t細(xì)胞充分溶解，制備好細(xì)胞懸液后應(yīng)盡快上機(jī)檢測(cè)。

但是在臨床實(shí)踐過(guò)程中，因?yàn)槌檠獣r(shí)間，儀器使用及人員的安排等條件限制，很難做到及時(shí)檢驗(yàn)，標(biāo)本放置時(shí)間延長(zhǎng)，尤其是經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和儲(chǔ)存的樣本死細(xì)胞數(shù)量增多，死細(xì)胞對(duì)許多抗體均有很強(qiáng)的非特異性染色，影響檢驗(yàn)結(jié)果。為了合理利用各種資源，同時(shí)保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。有必要了解存放時(shí)間和存放溫度對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。

本研究結(jié)果提示標(biāo)本室溫放置72 h或4℃冰箱內(nèi)放置72 h，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，但超過(guò)72 h之后，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)果呈下降趨勢(shì)，放置時(shí)間越長(zhǎng)，下降幅度越大。

同時(shí)刺激法流式細(xì)胞檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子操作復(fù)雜，影響因素較多，存在以下幾個(gè)方面的問(wèn)題，激活劑可導(dǎo)致部分表面分子表達(dá)下調(diào)；細(xì)胞破膜過(guò)程可影響抗體與細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的特異性結(jié)合；染色破膜的細(xì)胞為死亡的細(xì)胞, 難以再進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)；儀器設(shè)備、人員素質(zhì)、試劑來(lái)源等諸多因素造成不同批次的試劑，不同的操作人員的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題也對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響[11]。因此，當(dāng)Th1與Th2由產(chǎn)生的細(xì)胞因子來(lái)判斷對(duì)疾病的診斷價(jià)值時(shí)，每批實(shí)驗(yàn)樣本的檢驗(yàn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行質(zhì)量控制。臨床在判斷Th1、Th2兩個(gè)亞群時(shí)，在檢測(cè)方法上的一致性至關(guān)重要。