徐有斌，章海紅

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江臺(tái)州 318000）

泰樂菌素是從弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)多種革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用，還對(duì)部分革蘭氏陰性菌、彎桿菌、螺旋體有抑制作用，并具有抗球蟲作用，已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)的畜禽疾病防治或作為促生長的飼料添加劑。

泰樂菌素由微生物發(fā)酵培養(yǎng)獲得，在泰樂菌素發(fā)酵代謝過程中，產(chǎn)生的尾氣中包含大量CO2及剩余的O2，通過質(zhì)譜儀在線檢測(cè)尾氣中的CO2及O2，再經(jīng)過計(jì)算獲得發(fā)酵過程中的CO2釋放速率（CER）、攝氧率（OUR）及呼吸熵（RQ）等呼吸代謝參數(shù)，可以很直觀地反應(yīng)菌體代謝的狀況，在發(fā)酵種子移種條件、發(fā)酵過程狀態(tài)識(shí)別、優(yōu)化供氧水平、產(chǎn)率預(yù)測(cè)以及優(yōu)化發(fā)酵工藝等方面都有一定的指導(dǎo)意義，并在生產(chǎn)應(yīng)用中取得了良好的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種為自有菌種，弗氏鏈霉菌。

1.2 主要設(shè)備

PrimaδB質(zhì)譜儀，美國Thermo ONIX公司；24 m3種子罐和150 m3發(fā)酵罐，發(fā)酵罐配置在線pH及溶解氧（DO）均為梅特勒特利多公司生產(chǎn)；1260液相色譜儀，美國AGILENT。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)溫度32 ℃，培養(yǎng)結(jié)束后，按8%～15%移種量接入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，溫度30 ℃培養(yǎng)，控制pH約7.0。

1.4 分析測(cè)試方法

效價(jià)采用HPLC測(cè)定，取發(fā)酵液樣品至100 mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，過濾。檢測(cè)條件為：波長280 nm；色譜柱C18，4.6 mm×200 mm，5 μm或者相當(dāng)；流動(dòng)相為2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈=60∶40。

菌濃采用濕重法測(cè)定，10 mL發(fā)酵液在3 000 r/min條件下離心15 min；DO在移種后標(biāo)定相對(duì)飽和度為95%；CER、OUR和RQ分別根據(jù)公式（1）～（3）計(jì)算，并均由計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵種子移種條件

泰樂菌素發(fā)酵種子階段，處于發(fā)酵的早期生長階段，其中一個(gè)重要的生長指標(biāo)為CO2的產(chǎn)生，通過分析尾氣中的CO2含量，并結(jié)合pH、DO的變化趨勢(shì)，可以很好地了解種子的生長狀態(tài)，量化移種條件，便于操作人員進(jìn)行操作。

圖1為泰樂菌素種子生長階段典型的趨勢(shì)。由圖可以看出生長過程中，pH與CER趨勢(shì)具有明顯的特征對(duì)應(yīng)關(guān)系。種子培養(yǎng)前期，培養(yǎng)基中的淀粉類碳源會(huì)水解成葡萄糖，而葡萄糖作為碳源被菌體有氧呼吸利用并產(chǎn)生各種酸性物質(zhì)，如丙酮酸及三羧酸（TCA）循環(huán)中各種中間代謝物。隨著葡萄糖利用速度的逐漸增大，呼吸強(qiáng)度也相應(yīng)上升，但因處于培養(yǎng)適應(yīng)期，菌絲量較少，pH下降趨勢(shì)不明顯。中期，隨著培養(yǎng)基中部分氮源氨基酸脫氨基后直接參與到菌絲生長代謝，此階段會(huì)伴隨NH4+的釋放，從而導(dǎo)致pH上升并產(chǎn)生CO2。且由于菌絲大量產(chǎn)生，CER也明顯升高。后期，CER變化趨勢(shì)也同步pH的變化趨勢(shì)，表現(xiàn)出一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

通常在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，為了避免染菌，往往在種子培養(yǎng)階段盡量減少發(fā)酵罐的各種死角。而通過利用發(fā)酵尾氣檢測(cè)，泰樂菌素種子階段的生長趨勢(shì)也能進(jìn)行在線識(shí)別，是一種對(duì)發(fā)酵移種時(shí)機(jī)的把握更具數(shù)據(jù)化的手段。

圖1 種子代謝趨勢(shì)

2.2 發(fā)酵過程狀態(tài)識(shí)別

泰樂菌素發(fā)酵具有典型的微生物發(fā)酵規(guī)律性，分為遲滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰亡期。以往一般通過發(fā)酵過程的DO/pH等趨勢(shì)，結(jié)合鏡檢、菌絲濃度的檢測(cè)進(jìn)行判別，但是由于離線檢測(cè)的時(shí)效性及精度，過程識(shí)別較為困難。在泰樂菌素發(fā)酵過程中，過程判斷并進(jìn)行控制的好壞，對(duì)發(fā)酵影響較大，通過引入尾氣分析，對(duì)其中的CER、OUR及RQ進(jìn)行分析，可以很好地區(qū)分發(fā)酵過程中的各個(gè)狀態(tài)。

圖2為泰樂菌素發(fā)酵較為典型的趨勢(shì)，圖3為泰樂菌素發(fā)酵代謝尾氣分析趨勢(shì)。結(jié)合圖2及圖3分析可以看到，發(fā)酵前期因菌絲利用淀粉類碳源分解成葡萄糖，進(jìn)而進(jìn)行有氧呼吸，產(chǎn)生各種有機(jī)酸，導(dǎo)致pH快速下降；泰樂菌素發(fā)酵前期生產(chǎn)速度很快，遲滯期時(shí)間相當(dāng)短暫。之后隨著菌體量大量繁殖，菌體利用酸性物質(zhì)的速率加大，培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)的濃度逐漸降低，pH開始反彈。當(dāng)pH反彈到一定程度時(shí)，淀粉類碳源的水解速度已與菌體對(duì)葡萄糖的需求有相當(dāng)大的差距，為滿足菌體生長的需要，菌體開始利用其他可利用的碳源，如有機(jī)氮源中谷氨酸（Glu）和丙氨酸（Ala）的氨基部分可用作氮源，而脫氨基后形成的酮酸部分可被菌體利用作為碳源，與此同時(shí)還會(huì)釋放一定堿性物質(zhì)NH4+，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的pH上升，從圖3也可以看出此階段RQ值有所上升。之后發(fā)酵液中可被菌體快速利用的有機(jī)氮源的量也是有限的，所以當(dāng)pH上升到一定幅度后又緩慢下降，同時(shí)CER增長的趨勢(shì)下降。所以泰樂菌素發(fā)酵尾氣數(shù)據(jù)與pH的相關(guān)性，反映了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的淀粉類水解速率與菌體對(duì)葡萄糖的利用速率之間與菌體利用不同的碳源導(dǎo)致的動(dòng)態(tài)平衡。此階段，尾氣數(shù)據(jù)快速變動(dòng)，同時(shí)也表明了菌絲的生長階段進(jìn)入快速生長期。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入40 h后，菌絲的呼吸強(qiáng)度（如CER及OUR）又開始逐步上升，且RQ值逐漸下降至0.7～0.8，此數(shù)值作為典型的菌體利用豆油的RQ值，基本上表明豆油已作為泰樂菌素發(fā)酵的唯一碳源，此階段開始泰樂菌素效價(jià)快速增長，進(jìn)入產(chǎn)素期。

從尾氣數(shù)據(jù)看，中后期OUR及CER同比例有所下降，呼吸強(qiáng)度降低，表明菌絲過早進(jìn)入衰亡期，具體表現(xiàn)在效價(jià)的增幅放緩。綜合pH、DO以及OUR、CER、RQ的變化趨勢(shì)，發(fā)酵操作人員很容易對(duì)泰樂菌素發(fā)酵的各個(gè)階段進(jìn)行很好的識(shí)別，從而指導(dǎo)各個(gè)階段的精確控制以及發(fā)酵終點(diǎn)的判斷。

2.3 優(yōu)化供氧水平

泰樂菌素發(fā)酵采用豆油作為碳源，且作為典型的有氧發(fā)酵，在生產(chǎn)過程中，需要良好的供氧水平才能保障發(fā)酵的正常進(jìn)行。為確保泰樂菌素發(fā)酵過程獲得適當(dāng)?shù)娜苎?，需控制泰樂菌素發(fā)酵過程的DO在臨界氧濃度左右，避免因DO不足導(dǎo)致的代謝異?；蛘逥O過高引起的能源浪費(fèi)以及可能對(duì)菌絲造成的傷害。

根據(jù)圖4中DO與尾氣OUR數(shù)據(jù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以很直觀地確定臨界氧濃度，因發(fā)酵段時(shí)間內(nèi)的參數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，氧傳遞系數(shù)（KLa）也大致穩(wěn)定。隨著OUR升高，DO呈下降趨勢(shì)；反之，OUR降低，則DO開始上升。當(dāng)DO降低至臨界氧濃度以下，則出現(xiàn)OUR變化趨勢(shì)與DO一致的情況，即同時(shí)上升或下降。

2.4 產(chǎn)率預(yù)測(cè)

泰樂菌素發(fā)酵產(chǎn)素期間，主要碳源來源于豆油，OUR的變化趨勢(shì)與效價(jià)增長有一定的關(guān)聯(lián)性，從圖3分析，OUR在發(fā)酵中后期下降，后期的效價(jià)增長幅度也變小，基于以上分析，在泰樂菌素發(fā)酵過程中，可以通過查看OUR的變化趨勢(shì)，來獲得產(chǎn)率的變化預(yù)測(cè)，從而及時(shí)提醒技術(shù)人員采取應(yīng)對(duì)措施。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

圖3 泰樂菌素發(fā)酵代謝尾氣分析趨勢(shì)

基于對(duì)OUR變化趨勢(shì)與效價(jià)增長方面的關(guān)聯(lián)性，為獲得后期更好的效價(jià)增長，對(duì)發(fā)酵中后期的OUR進(jìn)行干預(yù)。分析認(rèn)為，發(fā)酵中后期氮源的不足會(huì)引起豆油代謝的減弱，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中增加適量的氮源，可以避免中后期OUR的下降。在試驗(yàn)過程中，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的棉籽餅粉、魚粉及玉米蛋白粉的含量同時(shí)提高0.2%左右，培養(yǎng)參數(shù)相同的情況下，效價(jià)增長的趨勢(shì)如圖5所示。將氮源含量提高后，雖然中期OUR的絕對(duì)值低于未調(diào)整時(shí)，但中后期OUR保持穩(wěn)定并有一定的回升趨勢(shì)，表現(xiàn)在發(fā)酵中后期效價(jià)的增長趨勢(shì)未下降，相較于調(diào)整前，發(fā)酵罐效價(jià)提高了14.8%。在大規(guī)模生產(chǎn)中，泰樂菌素發(fā)酵代謝經(jīng)常受原材料影響產(chǎn)生波動(dòng)，通過監(jiān)測(cè)尾氣參數(shù)及時(shí)調(diào)整工藝控制，對(duì)穩(wěn)定發(fā)酵生產(chǎn)水平有較大幫助。

圖4 泰樂菌素發(fā)酵OUR與DO趨勢(shì)

圖5 改良前后泰樂菌素OUR與效價(jià)增長趨

2.6 其他方面的應(yīng)用

尾氣分析在發(fā)酵中還有其他方面的應(yīng)用，如發(fā)酵染菌會(huì)引起OUR、CER 的異常變化，且根據(jù)染菌的種類，其OUR、CER 的趨勢(shì)也不相同，掌握其染菌的種類與相應(yīng)的尾氣變化趨勢(shì)，可以初步判斷染菌的種類。

3 結(jié)論

通過分析泰樂菌素發(fā)酵中尾氣參數(shù)的變化，結(jié)合發(fā)酵過程中常規(guī)的在線DO、pH等監(jiān)測(cè)值，對(duì)泰樂菌素發(fā)酵種子移種條件判斷、發(fā)酵狀態(tài)識(shí)別、優(yōu)化供氧水平、產(chǎn)率預(yù)測(cè)、工藝優(yōu)化等方面起到很好的指導(dǎo)作用。且尾氣在線監(jiān)測(cè)取樣點(diǎn)位于排氣管，不影響發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)，不直接接觸發(fā)酵液，無發(fā)酵染菌影響。相信在泰樂菌素或其他產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)中引入尾氣分析可以推動(dòng)發(fā)酵技術(shù)水平的進(jìn)步。