袁留生，周偉

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 化學(xué)系，上海 200032）

人參皂苷Compound K（CK）是天然的二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rc等在人腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物[1]，目前主要通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化或糖苷酶水解制備[2]。作為一個(gè)多靶點(diǎn)、高活性化合物，CK具有非常廣闊的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值[3]。本課題組Zhou和Yan等人在前期研究中已經(jīng)建立了較完整的微生物轉(zhuǎn)化制備工藝[4-5]，但目前的工藝還存在較多不足之處，如摩爾轉(zhuǎn)化率還不夠高，轉(zhuǎn)化底物的普適性還有待拓展，硅膠柱純化工藝成本高、收率偏低，最終產(chǎn)品的純度較低，還達(dá)不到原料藥純度（98%）等，所以工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，并建立新的純化工藝，以進(jìn)一步提高CK成品的收率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料

三七莖葉總皂苷，紅云生物技術(shù)有限公司；三七二醇總皂苷，云南香格喜瑪生物技術(shù)有限公司；人參皂苷CK標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制（純度＞99%）。

主要培養(yǎng)基由葡萄糖、蔗糖、酵母粉、花生粉、大豆蛋白、玉米麩皮、黃豆粉，瓊脂粉、麩皮粉構(gòu)成，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供。

(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、乙醇、甲醇、丙酮和磷酸等，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈，HPLC級(jí)，購(gòu)自Thermo Fisher（美國(guó)）；95%工業(yè)乙醇，購(gòu)自滄盛化工有限公司（河北）。大孔樹(shù)脂D101、H41、S80、H60、AB-5，購(gòu)自天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司；GF254薄層色譜硅膠預(yù)制板，購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 設(shè)備

1100系列高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器，Agilent USA；10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；ZWY-211G旋轉(zhuǎn)式搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZHJH-1112C型超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；FA1104型分析天平，上海橫平儀器儀表廠；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA Japan；

1.3 菌株

擬青霉菌Paecilomyces Bainier sp.229，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 HPLC分析方法

1.4.1.1 人參皂苷CK分析方法

色譜柱：C18（Agilent XDB，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水=48∶52；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.1.2 人參皂苷Rb1分析方法

色 譜 柱：C18（Agilent SB，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫，0～21 min，27%～35%（乙腈）；21～24 min，35%～50%（乙腈）。流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 不同皂苷底物的比較

對(duì)三七二醇型皂苷中Rb1的含量進(jìn)行HPLC檢測(cè)；分別對(duì)三七莖葉總皂苷和三七二醇型皂苷這兩者的發(fā)酵轉(zhuǎn)化結(jié)果進(jìn)行比較，以選擇更優(yōu)的轉(zhuǎn)化底物[6]。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基和底物投料方式的優(yōu)化

在前期研究中發(fā)現(xiàn)氮源選擇對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較大，效果較好的氮源有黃豆餅粉、花生餅粉和酵母粉。如表1所示，設(shè)置3組發(fā)酵培養(yǎng)基[7]。合適的底物誘導(dǎo)對(duì)糖苷酶的產(chǎn)生有較大的影響，如表2所示，試驗(yàn)中以優(yōu)選的皂苷為轉(zhuǎn)化底物，設(shè)計(jì)了4種誘導(dǎo)方式。通過(guò)不同發(fā)酵培養(yǎng)基的組合并結(jié)合不同的底物誘導(dǎo)和投料方式進(jìn)行比較篩選。

1.4.4 10 L罐上發(fā)酵條件優(yōu)化

采用優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基和底物投料方式，利用全自動(dòng)發(fā)酵罐的功能優(yōu)勢(shì)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溶氧和轉(zhuǎn)化溫度等關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行精確控制優(yōu)化。通過(guò)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)，控制發(fā)酵初期和轉(zhuǎn)化后期的溶氧水平，以觀察溶氧對(duì)轉(zhuǎn)化的影響；通過(guò)對(duì)菌體生長(zhǎng)和加入底物后轉(zhuǎn)化期間的溫度控制，以觀察溫度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.4.5 大孔樹(shù)脂的篩選

大孔吸附樹(shù)脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附選擇性獨(dú)特、解吸條件溫和、再生簡(jiǎn)便、有機(jī)溶劑用量少以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于人參皂苷的純化[8-9]。本研究分別對(duì)D101、H41、S80、H60、AB-8五種大孔樹(shù)脂進(jìn)行篩選，比較分離后目標(biāo)樣品的純度，并計(jì)算回收率。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成

表2 誘導(dǎo)方式

1.4.6 洗脫條件的優(yōu)化

以優(yōu)選的大孔樹(shù)脂在相同的上樣條件下采用不同的洗脫溶劑和比例，進(jìn)行洗脫條件的優(yōu)化。篩選的洗脫條件包括：（1）55%丙酮洗滌，65%丙酮洗脫；（2）50%乙醇洗滌，70%乙醇洗脫；（3）50%乙醇洗滌，80%乙醇洗脫。

1.4.7 結(jié)晶工藝優(yōu)化

采用甲醇、甲醇-水、丙酮、丙酮-水、乙醇的溶劑體系對(duì)CK進(jìn)行結(jié)晶[10]，比較不同溶劑體系對(duì)純度和收率的影響，篩選最佳的結(jié)晶工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同皂苷底物的比較

2.1.2 三七二醇型總皂苷底物Rb1含量的檢測(cè)

通過(guò)HPLC方法對(duì)三七二醇型總皂苷中Rb1含量進(jìn)行檢測(cè)，如圖1所示，可以看到三七二醇型總皂苷中Rb1含量高，更適合用于CK的制備，其他皂苷的種類少、含量低。

圖1 三七二醇型皂苷HPLC圖譜

2.2 不同皂苷底物CK轉(zhuǎn)化率比較

三七莖葉總皂苷CK摩爾轉(zhuǎn)化率為28.8%±1.38%，三七二醇總皂苷CK摩爾轉(zhuǎn)化率為71.70%±1.52%。如圖2所示，對(duì)兩種不同轉(zhuǎn)化底物的發(fā)酵液采用乙醇提取后，經(jīng)HPLC檢測(cè)分析，三七二醇型皂苷比三七莖葉總皂苷轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的雜質(zhì)明顯要少，而三七莖葉總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中6.522 min處存在一個(gè)含量比較高的副產(chǎn)物，會(huì)嚴(yán)重影響CK的分離純化收率。從以上結(jié)果可知，三七二醇型總皂苷Rb1含量高，轉(zhuǎn)化率高，經(jīng)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的雜質(zhì)組分少，有利于后續(xù)純化工藝，是制備CK優(yōu)選的轉(zhuǎn)化底物。

圖2 不同皂苷底物CK轉(zhuǎn)化HPLC圖譜

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基和底物投料方式的優(yōu)化

從表3可知，在所考察的氮源中，3%酵母粉和0.5%玉米麩皮相比于其他氮源組合對(duì)轉(zhuǎn)化更有利。根據(jù)摩爾轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，提前誘導(dǎo)相較于直接投料可以顯著提高CK轉(zhuǎn)化率，在生長(zhǎng)24 h左右進(jìn)行誘導(dǎo)，以0.1%的誘導(dǎo)量最好，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到了81.9%。

表3 不同發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)化率結(jié)果

2.4 10 L罐上發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 溶氧調(diào)節(jié)

發(fā)酵初期，溶氧快速下降，發(fā)酵24 h，發(fā)酵液粘稠，溶氧＜5%，不利于菌體生長(zhǎng)。因此在4.5 h溶氧達(dá)到設(shè)定值30%時(shí)，開(kāi)始關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速，以盡量減慢溶氧下降速度，轉(zhuǎn)化率提高至85%左右。

2.4.2 溫度控制

考慮到后期菌體自溶比較嚴(yán)重，降低了轉(zhuǎn)化溫度，由32 ℃降低為28 ℃，并通過(guò)降低轉(zhuǎn)速來(lái)降低后期溶氧和剪切力。圖3表明，該法十分有效，轉(zhuǎn)化率上升至91.8%。

2.4.3 大孔樹(shù)脂的選擇

圖3 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線

采用40 mm×500 mm規(guī)格的層析柱分別裝填D101、H41、S80、H60、AB-8五種大孔樹(shù)脂填料，控制裝填高度40 cm，裝填填料體積500 mL。純化過(guò)程中收集目標(biāo)組分，經(jīng)HPLC檢測(cè)，計(jì)算純度和回收率。從表4可知，H41相比較其他弱極性或低極性大孔樹(shù)脂有更好的分離效果，經(jīng)純化后目標(biāo)CK產(chǎn)品純度為93.2%，回收率為78.3%，所以最終確定H41為工藝優(yōu)選的填料。

表4 不同類型大孔樹(shù)脂篩選純化結(jié)果

2.5 洗脫條件的優(yōu)化

以H41柱，采用乙醇替代丙酮進(jìn)行洗脫條件的優(yōu)化，計(jì)算純度和回收率。由表5可知，乙醇作為洗脫溶劑與丙酮相比，產(chǎn)品純度和回收率接近，因此可以采用乙醇替代丙酮作為洗脫溶劑，優(yōu)選的洗脫條件為：采用與上樣樣品相同的50%乙醇濃度進(jìn)行洗滌，80%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.6 結(jié)晶工藝優(yōu)化

考察不同結(jié)晶溶劑包括甲醇、甲醇-水、丙酮、丙酮-水、乙醇-水等的結(jié)晶效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK在以上溶劑中均有較好晶型。其中，CK在甲醇-水中結(jié)晶速率快、收率高、晶形好、純度高。CK濃度未100 mg/mL，甲醇與水的比例為100∶65的條件下，具有最好的結(jié)晶效果，一次結(jié)晶純度達(dá)到96.8%。在甲醇-水體系中再增加一次重結(jié)晶，CK純度便可進(jìn)一步提高，達(dá)到了98.1%以上。

表5 不同洗脫條件篩選的純化結(jié)果

2.7 純化工藝重復(fù)驗(yàn)證

按照以上工藝，進(jìn)行連續(xù)三批的放大生產(chǎn)，單批純化300 mL乙醇濃縮液（CK濃度22.5 mg/mL），最后所得CK成品的純度和純化總收率如表6所示，中間品HPLC譜圖如圖4所示。從結(jié)果可知，三批放大生產(chǎn)結(jié)果穩(wěn)定，CK成品純度達(dá)到了化學(xué)原料藥大于98%的標(biāo)準(zhǔn)。

表6 三批次純化結(jié)果

圖4 CK純化中間品HPLC圖譜

3 結(jié)論

三七二醇型總皂苷發(fā)酵轉(zhuǎn)化率高，且經(jīng)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的雜質(zhì)組分少，是制備CK優(yōu)選的轉(zhuǎn)化底物；3%酵母粉和0.5%玉米麩皮相比其他氮源組合對(duì)轉(zhuǎn)化更有利；根據(jù)摩爾轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，提前誘導(dǎo)相比直接投料可以顯著提高CK轉(zhuǎn)化率；在10 L發(fā)酵罐上通過(guò)控制發(fā)酵前期和后期的溶氧并降低轉(zhuǎn)化溫度，取得了良好的效果，CK摩爾轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高，達(dá)到了91.8%。建立的大孔樹(shù)脂純化新工藝，較之前的硅膠柱分離更簡(jiǎn)單可行，成本更低；并通過(guò)重結(jié)晶，最終使CK成品純度較原工藝有顯著提高，達(dá)到98%以上，純化總收率可保持在70%左右。整個(gè)發(fā)酵和純化工藝易于放大，為將來(lái)CK的新藥研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。