王中平，范曉英，李亮亮，武京學(xué)，張文娟，董魁，馬立東，喬冠恩(通信作者)

（1.邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市中心醫(yī)院感染科，河北 邯鄲056000；3.成安縣中醫(yī)院 內(nèi)科，河北

邯鄲056700 ；4.館陶縣人民醫(yī)院 消化科，河北 邯鄲 057750）

0 引言

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，具有極高的患病率和致死率，在所有癌癥的患病率及致死率排名中，EC 分別為第8 位和第6 位[1]。根據(jù)病理學(xué)分類，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見(jiàn)的EC 病理類型[2]，我國(guó)約90%左右EC 患者的病理學(xué)分型是ESCC。目前，我國(guó)ESCC 存在臨床治療效果不佳、預(yù)后較差的特點(diǎn)[3]，但到目前為止，ESCC 確切的病因及分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明，因此，闡明ESCC 的發(fā)病機(jī)制非常重要。微小RNA（miRNAs）既可作為致癌分子也可作為抑癌分子，通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)水平而對(duì)癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響[4]。miR-106b-3p 和miR-214 在ESCC 中的具體功能，目前鮮有報(bào)道。本研究采用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)ESCC 患者和健康者的血漿中miR-106b-3p 和miR-214 表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料，探討它們與ESCC 的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 ESCC 患者

取2016 年06 月至2017 年08 月邯鄲市第一醫(yī)院及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的ESCC 患者的外周血，共40 例。其中男性23 例，女性17 例，年齡38～77 歲，平均（60.9±11.6）歲。所有患者均無(wú)其他腫瘤病史，釆取外周血標(biāo)本前及手術(shù)前均未行放療、化療、生物治療等干預(yù)措施。

1.1.2 健康體檢者

收集30 例同期健康志愿者的外周血，均無(wú)腫瘤、高血壓、糖尿病、心臟病等病史。與ESCC 患者在性別、年齡等情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑

Trizol 試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，PCR 試劑盒購(gòu)于徳國(guó)Roche 公司，引物由南京金斯瑞公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本釆集與處理

采集ESCC 患者和健康體檢者空腹靜脈血4mL,迅速注入EDTA 采血管中，輕輕混勻，4℃ 3500×g 離心10min，取上淸液放入新的無(wú)RNA 酶EP 管中，放置-80℃冰箱中待用。

1.3.2 血漿中總RNA 的提取

取EP 管中的血漿標(biāo)本250ul，加入750ul Trizol 裂解液，混勻后依次加入三氯甲烷、異丙醇等試劑，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA?？俁NA 經(jīng)NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)測(cè)定濃度

及純度，并電泳檢測(cè)RNA 完整性，質(zhì)量合格后用DEPC 水溶解保存在-80℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取2ulRNA 入EP 管中，用DEPC 水加至11ul，65 ℃放置5 min 后冰浴5 min 離心，加入5×Reaction buffer 4.0ul、dNTPs 2.0ul、Rnase Inhibitor1.0ul、RT 酶 1.0ul，離心后42℃孵育60min，70 ℃反應(yīng)10 min 后立即取出冰浴冷卻，合成cDNA，于-20℃保存。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)

合成cDNA 后，以Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量PCR 試劑盒來(lái)擴(kuò)增目的基因，U6 為內(nèi)參基因，血漿miRNA 含量釆用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔct 表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad5.0 軟件分析數(shù)據(jù)。多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析,兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，采用ROC 曲線分析miR-1O6b-3p 及miR-214 對(duì)ESCC 診斷價(jià)值，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者和健康體檢者的血漿miR-106b-3p、miR-214 表達(dá)情況

在食管鱗癌患者術(shù)前的血漿中miR-106b-3p 及miR-214 表達(dá)量分別為（0.684±0.13）及（0.832±0.14），健康體檢者的血漿中 miR-l06b-3p、miR-214 表達(dá)量分別為（0.21±0.03）及（0.28±0.05）,兩者與健康組相比存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 miR-106b-3p 及miR-214 的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

通過(guò)對(duì)臨床及病理資料的分析，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者血漿miR-IO6b-3p 及miR-214 隨著患者TNM 分期増加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,而與患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

2.3 血漿miR-1O6b-3p 和miR-214 診斷食管鱗癌的價(jià)值

經(jīng)過(guò)ROC 曲線分析顯示，術(shù)前血漿miR-1O6b-3p 相對(duì)表達(dá)量診斷食管鱗癌的最佳臨界值為≤0.169，AUC 為0.833,敏感性為74.5%，特異性為82.6%。術(shù)前血漿miR-214 相對(duì)表達(dá)量診斷食管鱗癌的最佳臨界值為≤0.169，AUC 為0.834,敏感性為76.2%，特異性為84.3%。

3 討論

miRNAs 是調(diào)節(jié)人類表觀遺傳的重要分子之一，是一類長(zhǎng)度大小約為20-22 個(gè)核苷酸左右的非編碼小RNA，參與了人體幾乎所有的生物學(xué)調(diào)節(jié)途徑[5,6]。miRNAs 能夠通過(guò)其堿基序列區(qū)域與其相應(yīng)靶目標(biāo)mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）中的互補(bǔ)堿基序列進(jìn)行完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，在基因的轉(zhuǎn)錄后階段調(diào)控其相應(yīng)靶目標(biāo)mRNA 的表達(dá)水平。在癌癥中，miRNAs 既可作為致癌分子也可作為抑癌分子，通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)水平從而對(duì)癌癥細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響。在人類miRNAs 中，約50%左右的miRNAs 所在的基因組區(qū)域與癌癥之間存在密切的聯(lián)系[7]。因此，癌組織中異常表達(dá)的miRNAs 對(duì)腫瘤的早期診斷、組織類型的分類及轉(zhuǎn)移及預(yù)后等方面有著極其重要的價(jià)值[8]。

miR-106b 是miR-106b-25 家族中的一員，在多種腫瘤中異常高表達(dá)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。李元梅等研究顯示，miR-106b 在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)癌旁組織，提示其在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用[9]；施莉等采用miRNA 表達(dá)芯片檢測(cè)了3 例胃癌患者組織標(biāo)本，結(jié)果示miR-106b 在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胃癌組織最高[10]；韓東等研究顯示食管鱗癌組織miR-106b 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織[11]。然而迄今為止，關(guān)于miR-lO6b-3p 在ESCC 患者血漿中表達(dá)的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ESCC 患者的血漿miR-106b-3p 表達(dá)水平明顯高于健康者 (P＜0.01 )，且隨著患者TNM 分期増加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而明顯上調(diào)，其診斷ESCC 的敏感性為74.5%，特異性為82.6%，和既往報(bào)道m(xù)iR-1O6b 的情況相似[12]，說(shuō)明miR-1O6b-3p 可作為一個(gè)新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志，在臨床上可通過(guò)檢測(cè)血漿miR-l06b-3p 來(lái)協(xié)助ESCC 的診斷及預(yù)后判斷。

miR-214 在不同腫瘤中的表達(dá)水平不同，可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲等過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。目前，血液miR-214 已被證實(shí)可作為乳腺癌、膀胱癌等多種癌癥的特異性標(biāo)志物而在臨床中應(yīng)用[14]。Li 等[15]應(yīng)用RTqPCR 檢測(cè)98 例原發(fā)性肝癌患者和3 株肝癌細(xì)胞中miR-214-3p 的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常肝組織相比，肝癌組織及復(fù)發(fā)肝癌組織中miR-214-3p 的表達(dá)下調(diào)，Yang 等[16]研究顯示，miR-214 在胃癌組織及細(xì)胞中均升高。關(guān)于miR-214 在ESCC 中的表達(dá)，Wang 等[17]的研究顯示其在ESCC 組織及細(xì)胞中的表達(dá)下降，認(rèn)為miR-214 在ESCC 中為抑癌基因，而Q1AO 等[18]研究發(fā)現(xiàn)是致癌基因。關(guān)于ESCC 患者血漿miR-214 的表達(dá)情況，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量PCR 方法檢測(cè)ESCC 患者及健康人群血漿miR-214 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ESCC 患者血漿miR-214 表達(dá)水平明顯高于健康者(P＜0.01), miR-214 表達(dá)水平與ESCC 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，ROC 曲線分析顯示其可作為區(qū)分ESCC 與健康者的分子標(biāo)志物，因此，臨床上miR-214 可作為新的輔助診斷ESCC 的血液腫瘤標(biāo)志物。

總之，上調(diào)的ESCC 血漿miR-1O6b-3p、miR-214 表達(dá)水平反映了ESCC 的進(jìn)展情況，可作為新的腫瘤分子標(biāo)志物及預(yù)后判斷指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)臨床診治具有一定的價(jià)值。